VEGF通过上调CCN2促HUVEC迁移和血管生成

曹玉净，吕秋霞

(河南省中医院1.创伤骨科;2.风湿骨病科，河南郑州450002)

骨折修复过程与机体多种细胞因子及组织之间协同作用密切相关。血管生成与骨生成关系紧密相连，尤其在骨修复过程中尤为重要［1］。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是促进血管生成的直接诱导因子，可出现于骨折愈合过程，特异性作用于内皮细胞，促进其增殖和血管生成，并可增加血管通透性［2］。结缔组织生长因子(connective tissue growth factor，CTGF/CCN2)属CCN 家族，能促进内皮细胞、成纤维细胞及平滑肌细胞分裂，参与血管生成和创伤愈合等重要过程［3］，但在骨形成和骨折愈合中作用尚不清楚。本实验探讨VEGF 诱导的成骨细胞中CCN2 对人脐静脉血管内皮细胞的影响，为骨形成和骨折愈合的治疗提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料

人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)(Promocell公司)，人成骨细胞(osteoblast)(天津卫凯生物工程有限公司)，由本实验室保存。DMEM 培养基、胎牛血清和DMSO(赛默飞世尔生物化学制品有限公司)，ELISA 试剂盒(Bio Tek 公司)，CCN2 抗体和对照抗体IgG(Santa Cruz 公司);VEGF165 (Abnova 公司)。

1.2 成骨细胞上清液的制备

成骨细胞接种至6 孔板中，PBS 洗涤1 次，换成不含血清的DMEM 培养12 h。PBS 洗涤，加入含有0.2%胎牛血清的DMEM，20 ng/mL VEGF 刺激，1 h后，更换含有0.2%胎牛血清DMEM。培养6 h 后收集细胞上层清液用于迁移实验和血管生成实验。同时制备未加VEGF 刺激的成骨细胞作为对照组。

1.3 CCN2 基因siRNA 序列的设计及转染成骨细胞

siRNA 片段由上海生工合成。靶向CCN2 的siRNA 序列为5'-AATGTTCTCTTCCAGGTCAGCCCT GTCTC-3'(正义链)和5'-AAGCTGACCTGGAAGA GAACACCTGTCTC-3'(反义链)。制备终浓度为80 nmol/L的siRNA-脂质体复合物，实验组加入CCN2-siRNA 混合物，同时设置空白对照组(control)。将人成骨细胞以2 ×105个/孔接种于6 孔板，待细胞增殖至70%～80%汇合时，更换无血清培养基，采用LipofetamineTM2000 将CCN2-siRNA 转染成骨细胞，每组实验重复3 次。

1.4 Real time PCR 法检测成骨细胞CCN2 mRNA 的表达

用RNAiso plus kit 试剂盒提取细胞总RNA，按照试剂盒要求操作。CCN2 上游引物序列:5'-GC AGGCTAGAGAAGCAGAGC-3'，下游引物序列:5'-AT GTCTTCATGCTGGTGCAG-3'［4］，检测按实验室常规方法进行PCR 扩增。定量PCR 采用的体系为:dNTPs 2 μL，10 ×缓冲液5 μL，上下游引物各10 皮摩尔，模板2 μL，加三蒸水至总体积50 μL;扩增条件为:预变性94 ℃5 min，进入循环，变性94 ℃1 min，退火60 ℃1 min，延伸72 ℃3 min，30 个循环后，72 ℃延伸5 min。以β-actin 为内参，依据2-ΔΔCT法分析相对基因表达水平，上述实验重复3 次。

1.5 酶联免疫吸附实验检测成骨细胞CCN2 含量

酶联免疫吸附法(ELISA)检测成骨细胞CCN2的含量，按说明书严格操作，每个实验重复3 次。

1.6 Transwell 法检测细胞迁移

参照文献［5］方法进行，取直径为6.5 mm、孔径为8.0 μm 的聚碳酯膜分离上、下两室的24 孔Transwell小室。实验前，聚碳酯膜上涂有PBS(含有10 μg/mL 纤连蛋白)4 ℃放置16 h。消化内皮细胞，终止消化后离心弃去培养液，(用PBS 洗1～2遍)，用含2%胎牛血清的DHEM 培养基重悬，调整细胞浓度至1 ×106/mL。取细胞悬液100 μL 加入Transwell 小室，相应的刺激因素加入到下室，各设4个复孔。37 ℃培养6 h 后，显微镜下计数。

1.7 Matrigel 实验检测管样结构的形成能力

每孔100 μL 基质胶均匀铺于48 孔培养板的底部，静置于37 ℃孵箱1 h，使基质胶凝固。消化、离心和重悬对数增殖期细胞，使重悬后的细胞浓度为5 ×105个/mL，细胞悬液以100 μL/孔加入基质胶已凝固的48 孔培养板中，将100 μL 含有无血清DMEM 加到对照组，实验组加入相应的成骨细胞上清液，每组设3 个复孔。48 h 于倒置显微镜下观察是否有管样结构形成，并测量已形成的管样结构长度，上述实验重复3 次。

1.8 统计学分析

所得数据用SPSS16.0 统计软件进行统计学分析，试验结果用均值±标准偏差(±s)表示，采用t检验进行统计学分析。

2 结果

2.1 VEGF 增加成骨细胞中CCN2 mRNA 的表达

VEGF 刺激12 h 后，成骨细胞中CCN2 mNRA 表达及蛋白含量均上调(P＜0.05，图1)。VEGF 呈时间和剂量依赖性上调成骨细胞中CCN2 表达(图2)。

图1 VEGF 作用12 h 后诱导成骨细胞中CCN2 的表达Fig 1 After treatment for 12 hours，VEGF induces the expression of CCN2 in osteoblasts(±s，n=3)

图2 VEGF 呈剂量和时间依赖性诱导CCN2 mRNA 表达Fig 2 VEGF induces CCN2 expression in a dose-and time-dependent manner(n=3)

2.2 成骨细胞产生的CCN2 可促进内皮细胞迁移

PC 组与正常对照组相比对内皮细胞迁移有明显的促进作用(P＜0.05)(图3)。加入抗CCN2 后，迁移明显降低(P＜0.05)(图3)。

图3 成骨细胞产生的CCN2 可促进内皮细胞的迁移Fig 3 Osteoblast-derived CCN2 promotes HUVEC migration (n=3)

与对照组相比，CCN2-siRNA 组CCN2 表达水平明显下调(P＜0.05，图4A)。沉默CCN2 后内皮细胞迁移情况(图4B):VEGF-OSE 组:CCN2-siRNA 组内皮细胞迁移能力较con-siRNA 组和PC 组明显降低(P＜0.05)。

2.3 成骨细胞中的CCN2 对内皮细胞体外成管的影响

VEGF-OSE 组:PC 组较正常对照组管样长度明显增加(P＜0.05)。VEGF-OSE 组，anti-CCN2 组较PC 组管样长度明显降低(P＜0.05)，con-IgG 组与PC 组比较无明显差别。OSE 组，3 组内皮细胞管样长度较正常对照组相比均无显著变化(图5)。

3 讨论

血管生成(angiogenesis)是骨折修复过程中的重要因素，它不仅对骨折部位提供营养，而且参与了骨折的修复过程［6］。VEGF 是目前已知的血管生成的重要介质之一，它可诱导血管生成，促进骨折愈合［7］。VEGF 还通过与其他生长因子相互作用来影响骨生长和修复过程。CCN2 是细胞功能和血管生成的重要调节分子，它可以促进细胞的增殖、迁移、存活和黏附［8］。CCN2 还通过参与整合素αvβ3 介导的血管内皮细胞黏附、诱导血管生成、促进游走、提高生长因子诱导的细胞增殖［9］。CCN2 促进血管生成有利组织修复和骨折愈合。

本研究通过体外培养成骨细胞和HUVEC，观察到VEGF 刺激成骨细胞后，CCN2 表达明显上调;成骨细胞产生的CCN2 增强内皮细胞迁移和管样结构形成等促血管生成能力。表明成骨细胞产生的CCN2 参与了内皮细胞迁移和管样结构形成，提示成骨细胞产生的CCN2 在内皮细胞血管生成和骨折愈合中可能发挥重要作用。本文为骨血管形成中成骨细胞和内皮细胞的关系提供了一些依据，成骨细胞产生的CCN2 可以成为骨折愈合治疗的一个新靶点。

图4 CCN2-siRNA 对内皮细胞迁移的影响Fig 4 Effect of CCN2-siRNA on HUVEC migration(n=3)

图5 成骨细胞产生的CCN2 对内皮细胞体外成管的影响Fig 5 Effect of osteoblast-derived CCN2 on capillary tube formation in vitro(n=3)

［1］Portal-Nunez S，Lozano D，Esbrit P.Role of angiogenesis on bone formation［J］.Histol Histopathol，2012，27:559-566.

［2］Clarkin CE，Gerstenfeld LC.VEGF and bone cell signalling:an essential vessel for communication?［J］.Cell Biochem Funct，2013，31:1-11.

［3］张蔷，林勇.结缔组织生长因子与血管重构的关系［J］.国际呼吸杂志，2006，26:220-222.

［4］Maeda-Uematsu A，Kubota S，Kawaki H，et al.CCN2 as a Novel Molecule Supporting Energy Metabolism of Chondrocytes［J］.J Cell Biochem，2014，115:854-865.

［5］李大明，程杰.生骨注射液对体外培养大鼠成骨细胞增殖和分化影响的实验研究［J］.中国中医急症，2009，18:2027-2028，2047.

［6］Kanczler JM，Oreffo RO.Osteogenesis and angiogenesis:the potential for engineering bone［J］.Eur Cell Mater，2008，15:100-114.

［7］Keramaris NC，Calori GM，Nikolaou VS，et al.Fracture vascularity and bone healing:a systematic review of the role of VEGF［J］.Injury，2008，2:45-57.

［8］Takigawa M.CCN2:a master regulator of the genesis of bone and cartilage［J］.J Cell Commun Signal，2013，7:191-201.

［9］Hall-Glenn F，De Young RA，Huang BL，et al.CCN2/connective tissue growth factor is essential for pericyte adhesion and endothelial basement membrane formation during angiogenesis［J］.PloS One，2012，7:e30562.