COPD患者肺组织中CTGF表达水平增加

周思静，李 敏，王 苒，许 锐，费黎明，祝清清，张 燕

(1.合肥市第三人民医院职业病科，安徽合肥230001;2.安徽医科大学第一附属医院呼吸内科安徽合肥230001;3.安徽医科大学第一附属医院肿瘤科，安徽合肥230001)

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)以气道、肺实质和肺血管的慢性炎性反应为特征［1］。结缔组织生长因子(connective tissue growth factor，CTGF)是一种新发现的生长因子，近年来，有研究结果表明，结缔组织生长因子还参与调节多种炎性反应［2］。本研究探讨COPD 的肺组织中CTGF 表达差异，为研究吸烟人群的COPD易患机制提供基础研究资料。

1 材料与方法

1.1 材料:肺组织标本来源于安徽医科大学第一附属医院胸外科2012年1月至2012年12月因肺部占位性病变行肺叶切除术的患者。将标本分为3 组(每组25 例):1)吸烟+COPD 组:均为吸烟的COPD 患者，均符合COPD 的诊断标准，且处于稳定期。2)吸烟组:均为未患COPD 的吸烟者。3)对照组:均无职业性粉尘与化学物质接触式，均无吸烟史，且未患COPD。本研究得到医院伦理委员会的审查和批准，在采集标本前均告知研究对象，并获得其本人同意。

1.2 方法

1.2.1 试剂:兔抗人CTGF 多克隆抗体、小鼠抗人-肌动蛋白抗体(Santa Cruz 公司)，Trizol 试剂(Invitrogen 公司)，反转录试剂盒和荧光定量PCR 试剂盒(Toyobo 公司)，SDS-PAGE 试剂盒、组织蛋白提取试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)，蛋白标志物(Fenmentas 公司)。所有引物均由上海生工生物工程公司设计合成。

1.2.2 采集组织标本:收集行肺叶切除手术后的肺组织标本，所取标本均远离病变(＞5 cm)，且肉眼观察无癌组织浸润。

1.2.3 荧光定量PCR 检测mRNA 表达:定量PCR 的结果采用2－ΔΔCt法来测定目的基因的相对表达。

1.2.4 免疫组化:石蜡切片常规脱蜡脱水，用兔抗人CTGF多克隆抗体作为一抗(Santa Cruz Biotechnology)，稀释度为1∶200。按试剂盒说明书操作。

1.2.5 Western blot 蛋白表达:取肺组织加入组织蛋白提取试剂，取等量蛋白上样，以β-actin 为内参照，用10%的SDSPAGE 凝胶电泳后，截取含CTGF 蛋白和β-actin 蛋白的凝胶，将蛋白电转至硝酸纤维素膜后，加入相应的一抗，4 ℃孵育过夜。洗膜后，加入相应的二抗孵育，洗膜后显影，用Quantity One 软件处理系统分析各条带的吸光度值(A)，计算蛋白相对表达量(CTGF/内参的吸光度比值)。

1.3 统计学:采用SPSS 13.0 统计软件进行统计学分析，计量资料以均数±标准差(±s)表示。多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用q 检验，计数资料比较采用卡方检验，相关性检验采用Pearson 相关分析方法。

2 结果

2.1 临床资料比较:吸烟+COPD 组的FEV1 占预计值百分比、FEV1/FVC 均显著低于对照组和吸烟组(表1)。

表1 各组研究对象临床资料Table 1 Clinical data from three groups(±s，%，n=25)

表1 各组研究对象临床资料Table 1 Clinical data from three groups(±s，%，n=25)

＊P＜0.05 compared with control and smoker.

groupFEV1 pred(%，images/BZ_3_296_691_329_735.png±s)FEV1/FVC(%)control104.5 ±13.781.2 ±5.3 smoker93.3 ±11.279.8 ±7.8 smoker+COPD74.6 ±10.4*63.1 ±6.1*

2.2 肺组织中CTGF 的mRNA 的表达:吸烟+COPD 组研究对象肺组织中CTGFmRNA 表达水平为4.28 ±0.43，高于吸烟组的(2.45 ±0.37，P＜0.05)，而吸烟组又高于不吸烟对照组的(1.02 ±0.15，P＜0.05)。

2.3 肺组织中CTGF 的表达:CTGF 表达于肺泡上皮细胞、小血管平滑肌细胞的细胞质中(图1)。

图1 肺组织中CTGF 的表达。Fig 1 CTGF expression in lung tissues (×400)

2.4 肺组织中CTGF 的蛋白表达:吸烟+COPD 组肺组织的CTGF 的蛋白表达为3.07 ±0.42 显著高于吸烟组的1.74 ±0.26(P＜0.05)和对照组的0.61 ±0.11(P＜0.05)。

2.5 CTGF 表达与肺功能的相关性:肺组织中CTGFmRNA表达量与FEV1 占预计值%和FEV1/FVC 均呈负相关(P＜0.05);肺组织中CTGF 的蛋白表达量与FEV1 占预计值%和FEV1/FVC 均呈负相关(P＜0.05)。

图2 Western blot 法检测各组肺组织中CTGF 的蛋白表达Fig 2 CTGF protein expression in lung tissues from groups using Western blot

3 讨论

吸烟是目前公认的导致COPD 发病的最重要危险因素，但仅有少部分吸烟者罹患COPD，提示吸烟者自身易感因素存在差异。有相关研究表明，结缔组织生长因子CTGF 广泛参与炎性细胞的募集或血管生成，进而在炎性反应中发挥作用［3］。

本研究显示，在吸烟组的肺组织中，CTGF 的mRNA 和蛋白表达较少，但吸烟+COPD 组的肺组织中CTGF 的mRNA和蛋白表达明显增加(图2)，提示CTGF 可能参与COPD 的炎性反应。CTGF 的mRNA 和蛋白表达水平还与肺部气流受限存在正相关关系，提示CTGF 升高与吸烟导致的肺部慢性炎性反应有一定关系。CTGF 参与吸烟诱导的COPD 患者慢性肺部炎性反应的机制，可能与CTGF 促进和激活TNF、IL-6、IL-8 和MCP1 等炎性因子和趋化因子的生成［4］、增加炎性细胞趋化性、附着性有关。

总之，本研究证实，CTGF 在肺组织中的表达与肺功能呈负相关，吸烟的COPD 患者肺组织中CTGF 表达明显高于吸烟未患COPD 者，提示CTGF 在肺组织中的表达与COPD 有一定相关性，但CTGF 的表达和吸烟致COPD 的发病是否存在一定程度的因果关系尚需进一步阐明，本研究结果为进一步研究CTGF 在吸烟致COPD 发病机制中的作用提供了前期理论依据，值得进一步探讨。

［1］Chung KF and Adcock IM.Multifaceted mechanisms in COPD:inflammation，immunity，and tissue repair and destruction［J］.Eur Res J，2008，31:1334-1356.

［2］Kular L，Pakradouni J，Kitabgi P，et al.The CCN family:a new class of inflammation modulators?［J］.Biochimie，2011，93:377-88.

［3］Bai T，Chen CC，Lau LF.Matricellular protein CCN1 activates a proinflammatory genetic program in murine macrophages［J］.J Immunol，2010，184:3223-3232.

［4］Wang X，McLennan SV，Allen TJ，et al.Regulation of pro-inflammatory and pro-fibrotic factors by CCN2/CTGF in H9c2 cardiomyocytes［J］.J Cell Commun Signal，2010，4:15-23.