IL-12加强BCG初免对小鼠抗结核免疫效果

王 婵，王新敏，章 乐，季 榕，吴江东，吴 芳，张万江

(石河子大学医学院1.病原生物学与免疫学教研室;2.病理生理教研室;3.第一附属医院泌尿外科;4.第一附属医院感染科;5.新疆地方与民族高发病教育部重点实验室，新疆石河子832002)

长期以来各国一直使用卡介苗(Bacillus Calmette Gerin)来预防结核病，但BCG 在不同地区的免疫保护效果差异显著，序贯免疫策略是单用一种疫苗产生的免疫效力不足时，使用相同或不同的疫苗来重复免疫接种可增强免疫效果［1-2］。本研究利用已经构建好的表达免疫调节因子的质粒(IL-12)作为在接种BCG 后连续使用，以观察BCG 初次免疫后IL-12 进行免疫加强的免疫效果。

1 材料与方法

IL-4 和IL-2 含量。

2 结果

2.1 各组血清特异性抗体IgG 的比较:免疫后BCG 组、BCG/IL-12 组和BCG/pcDNA3.1 组在3 个时间点的IgG 较同时间段对照组均有显著升高(P＜0.05)。其中，BCG/IL-12组IgG 高于其他各组(P＜0.05)(图1)。

1.1 材料:SPF 级6～8 周龄BALB/c 雌性小鼠24 只，由［新疆医科大学医学实验动物中心，使用许可证号SYXK(新)2003-0001］。IL-12 是以pcDNA3.1 为载体构建的表达型重组质粒(本实验室构建保存)。BCG(本实验室常规保存培养)。

1.2 方法

1.2.1 动物免疫:将小鼠随机分为PBS 对照组、BCG 组、BCG/IL-12 组、和BCG/pcDNA3.1 组，每组6 只。给4 组小鼠分别在第1 周注射PBS、BCG、BCG 及BCG，第3 和5 周分别注射PBS、PBS、IL-12、pcDNA3.1。

1.2.2 特异性抗体IgG 的检测(ELISA 法):以PBS 组小鼠血清作为阴性对照，将抗体滴度定义为:实验组和阴性对照组A490比值≥2.0 时为最大血清稀释倍数。

1.2.3 特异性淋巴细胞增殖实验(MTT 法):加强免疫后4，6 和8 周，每组分别取2 只小鼠，脾细胞混合后分孔培养，实验组加入PPD(1 μg/mL)刺激，培养结束前4 h 加XTT(5 g/L)4 μL 及VK3 2 μL(终浓度0.1 mmol/L)，培养终止后测定A450nm吸光度值，结果用刺激指数(stimulation index，SI)表示。SI=A实验值/A对照组。

1.2.4 细胞因子的诱生和测定:同样制备的脾细胞做5 个复孔，TB-PPD 进行刺激，按说明书操作，检测样品中IFN-γ、

2.2 特异性脾淋巴细胞增殖实验:加强免疫后，BCG 组、BCG/IL-12 组和BCG/pcDNA3.1 组在3 个时间点的增殖活性均显著高于对照组(P＜0.05)。与加强免疫后4 周相比，加强免疫后6 和8 周BCG/IL-12 组小鼠脾淋巴细胞的增殖均呈上升趋势，并且在加强免疫后8 周达到较高水平(图2)。

图2 特异性脾淋巴细胞增殖实验Fig 2 Lymphoproliferative response to these types of vaccines

2.3 细胞因子表达水平:在加强免疫后6、8 周时间点BCG/IL-12 组的IFN-γ、IL-2、IL-4 水平均高于其他各组(P＜0.05)(表1，2，3)。

表1 IFN-γ 变化水平Table 1 The changes of IFN-γ level in culture medium to these types of vaccines(±s，pg/mL，n=5)

表1 IFN-γ 变化水平Table 1 The changes of IFN-γ level in culture medium to these types of vaccines(±s，pg/mL，n=5)

＊P＜0.05 compared with PBS group;#P＜0.05 compared with BCG.

group4 weeks6 weeks8 weeks PBS62.2 ±10.359.2 ±8.061.6 ±8.0 BCG88.4 ±9.5*99.6 ±11.3* 115.6 ±14.6*BCG/IL12106.4 ±24.1*146.4 ±14.1* # 165.6 ±27.4* #BCG/pcDNA3.1 85.8 ±9.3*99 ±10.6*104.2 ±24.0*

3 讨论

结核杆菌的保护性免疫主要是细胞免疫，诱导更为强烈的细胞免疫应答是目前结核病疫苗研究的热点。IL-12 作为对体内免疫活性细胞诱导和调节作用最强、范围最广的细胞因子，在诱导Th0 细胞向Th1 型细胞发育过程中发挥重要作用，可明显增强细胞免疫功能［3］。故本实验采用已经构建好的表达IL-12 在BCG 初次免疫后对小鼠进行加强免疫，结果显示，采用BCG 初免并用IL-12 加强后IgG 水平开始升高，且6 和8 周后小鼠血清中抗PPD IgG 水平显著高于BCG 组。并可诱导较强的淋巴细胞增殖，产生高水平的IFN-γ 及IL-2。这些结果提示，IL-12 可改善传统BCG 对机体细胞免疫的刺激作用，进而产生高水平的IFN-γ，增强BCG 的免疫效应，共同促进机体产生较传统BCG 免疫更明显和维持时间更长的细胞免疫反应。

表2 IL-2 变化水平Table 2 The changes of IL-2 level in culture medium to these types of vaccines (±s，pg/mL，n=5)

表2 IL-2 变化水平Table 2 The changes of IL-2 level in culture medium to these types of vaccines (±s，pg/mL，n=5)

＊P＜0.05 compared with PBS group;#P＜0.05 compared with BCG group.

group4 weeks6 weeks8 weeks PBS29.8 ±2.825.8 ±4.827.6 ±3.1 BCG108.2 ±17.5* 159.4 ±21.7*223 ±13.1*BCG/IL-12123.6 ±19.6* 227.4 ±23.5* #312.4 ±33.0* #BCG/pcDNA3.1 107.2 ±14.0* 152.6 ±21.4*219.4 ±18.2*

表3 IL-4 变化水平Table 3 The changes of IL-4 level in culture medium to these types of vaccines (±s，pg/mL，n=5)

表3 IL-4 变化水平Table 3 The changes of IL-4 level in culture medium to these types of vaccines (±s，pg/mL，n=5)

＊P＜0.05 compared with PBS group.

group4 weeks6 weeks8 weeks PBS23 ±5.719.6 ±2.44.2 ±2.6 BCG41 ±6.6*57.6 ±7.9*71 ±2.6*BCG/IL-1247.2 ±5.5*51.4 ±7.2*63.8 ±8.8*BCG/pcDNA3.137.4 ±3.2*54.2 ±7.0*66.2 ±7.0*

［1］Yang HJ，Chen JY，Shi HJ，et al.Comparative study on different immune schemes of inactivated poliovirus vaccines prepared with Sabin and wild strains in rhesus monkeys［J］.Chinese J Biol，2013，26:750-753.

［2］Dye C，Willams BG.The population dynamics and control of tuberculosis［J］.Science，2010，328:856-861.

［3］Ling W，Wang XF.In vitro induction of specific anti-tumoral immunity against laryngeal carcinoma by using human interleukin-12 gene transfected dendritic cells［J］.Chinese Med J，2011，9:1357-1361.doi:10.3760/cma.j.issn.0366-6999.2011.09.016.