氟致成骨细胞内质网应激对骨转化基因表达的影响

张亚楼，孙小娜，李 甜，冯树梅，廖礼彬，邓 锋，钟近洁*

(1.新疆医科大学基础医学院组织胚胎学教研室，新疆乌鲁木齐830011;2.新疆疾病预防控制中心放射卫生科，新疆乌鲁木齐830011)

摄入过量氟能够引起成年人氟骨症。研究发现氟可以诱导成骨细胞内质网应激，同时会对成骨细胞的骨发生作用产生影响［1］。将氟诱导的成骨细胞内质网应激与骨转化基因进行联合系统的研究未见报道。本研究用PCR 芯片观察成骨细胞内质网应激情况下骨转化相关基因的变化，为探索氟中毒机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料:NaF，分析纯(上海生工公司)、RNeasy Plus Mini Kit、RT2 First Strand Kit 和RT2 SYBR Green qPCR Mastermix、PCR 芯片(未折叠蛋白反应PAHS-089ZA-2 和骨发生信号通路PAHS-026ZA-2)(Qiagen 公司)。

1.2 细胞培养:原代培养人成骨细胞(钟近洁教授赠送)，细胞在含10%胎牛血清的DMEM 培养基于37 ℃、5% CO2培养箱进行贴壁培养。

1.3 凋亡细胞的流式细胞仪检测:将成骨细胞接种于25 cm2的培养瓶中，待细胞长至镜下细胞汇合度为80%时，加入氟化钠(NaF)(0 和10 mg/L)作用24 h 后，制成单细胞悬液，用AnnexinⅤ和PI 双染色在流式细胞仪上进行早期细胞凋亡的检测。

1.4 PCR 芯片检测:用NaF 干预成骨细胞24 h 后，提取RNA。分光光度计测定其浓度，琼脂糖凝胶电泳测定其RNA完整性。取400 ng RNA 反转录合成cDNA，加样于PCR 芯片上，于荧光定量PCR 仪上进行实时定量PCR 反应。计算每张PCR 芯片中的每个基因的Ct 值。每种处理组重复用PCR芯片测定3 次。采用2－ΔΔCt方法比较相应基因的表达量变化。表达量差异在2 倍以上者为差异有意义基因。

2 结果

2.1 流式细胞仪检测凋亡结果:当氟化钠浓度为10 mg/L时，人成骨细胞凋亡率为14.2 %。

2.2 未折叠蛋白反应PCR 芯片结果:在总共84 个检测基因中表达下调的有:FBXO6 基因;表达上调的有:BIP、XBP1、ATF4、PERK、IRE1α、IRE1β、ERO1LB、JNK3、PDIA3、USP14、HSPA1L、HSPH1、HTRA4 和UGCGL1 等14 个基因。

2.3 骨发生PCR 芯片结果:表达上调的基因有:AHSG、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALPL)、二聚糖(biglycan，BGN)、BMP2、BMP3、BMP5、BMP6、BMP7、降钙素受体(calcitonin receptor，CALCR)、脊索蛋白(chordin，CHRD)、COL10A1、COL1A1、COL2A1、COL5A1、软骨寡聚物基质蛋白(cartilage oligomeric matrix protein，COMP)、DLX5、FLT1(VEGFR-1)、纤维连接蛋白(fibronectin，FN1)、GDF10、IGF1、IGF2、IHH、ITGA2(integrin alpha 2)、ITGAM(CD11B/integrin alpha M)、MMP10、MMP9、PDGFA、PHEX、骨桥蛋白(osteopontin，OPN)、TNF、TNFSF11、VEGFA;表达下调的基因有:NOG、VCAM1。其中:BMP2、BMP3、BMP5、BMP6、BMP7 属于骨形态发生蛋白家族;COL10A1、COL1A1、COL2A1、COL5A1 属于胶原家族;IGF1、IGF2 属于胰岛素样生长因子家族;ITGA2、ITGAM 属于整合素α 家族;MMP10、MMP9 属于基质金属蛋白酶家族;TNF、TNFSF11 属于肿瘤坏死因子家族;FLT1 和VEGFA 属于血管生长因子家族。各基因间的相互关系根据软件绘制如图1。

3 讨论

荧光定量PCR Array 是目前较为简单实用的检测基因表达的方法，能够1 次性检测84 个与UPR 相关的基因在mRNA水平上的表达，结果无需再进行实时荧光定量检测，可同时研究信号通路的大量基因。本研究利用这一技术研究氟化钠作用下成骨细胞内质网应激和骨发生信号通路，完整地了解这两面的变化情况。

从实验结果看，氟化钠诱导了人成骨细胞内质网应激，其标志分子BIP 和XBP1 均表达;此外诱导了3 条信号通路:PERK、IRE1 和ATF6，3 种分子均高表达。检出的ATF4 则属于PERK-Eif2α 途径下游的分子。说明内质网应激及未折叠蛋白反应被过量氟激活，以减轻未折叠蛋白质的堆积，避免后者造成细胞损伤。

图1 各骨转化基因间的相互关系图Fig 1 The interaction of bone turn-over genes

成骨细胞在过量氟作用下，激发了内质网应激，同时对成骨细胞分化也产生了影响。本研究结果很多已经获得了证实，如:氟对成骨细胞的BMP 家族分子的影响已被证实;对胶原家族的影响也已经证实［2］;本研究中氟对降钙素的影响与报道一致;而氟对MMP9 和VEGF 等影响也与以往报道相符［3］。对于氟作用下的DLX5(Dlx5 属于同源异型盒homeobox，Hox 基因家族)已有研究［4］。以上说明本研究结果是可靠的。

通过PCR 芯片研究结果发现，氟中毒研究中许多以前被孤立研究的基因相互间是有关联的，同时还发现了以前忽略的方面如整合素等，这也指出了今后研究的方向。内质网应激可能参与了氟对成骨细胞分化的作用。

［1］Zhou YL，Shi HY，Li XN，et al.Role of endoplasmic reticulum stress in aberrant activation of fluoride-treated osteoblasts［J］.Biol Trace Elem Res，2013，154:448-56.

［2］张亚楼，刘开泰，刘继文，等.氟对成骨细胞Runx2 和Osterix 表达的影响［J］.中国地方病学杂志，2011，30:23-26.

［3］申庆丰，李辉南，徐天同，等.慢性氟中毒大鼠脊髓血脑屏障损伤的研究［J］.中华医学杂志，2012，92:2357-2361.

［4］万良斌，于燕妮，万昌武.同源异型盒基因Dlx5 在氟中毒骨代谢中作用［J］.中国公共卫生，2013，29:620-622.