茶多酚对缺血-再灌注大鼠p38信号通路及细胞凋亡的影响*

西安交通大学第二附属医院麻醉科(西安710004) 赵红霞 高 滢

茶多酚对缺血-再灌注大鼠p38信号通路及细胞凋亡的影响*

西安交通大学第二附属医院麻醉科(西安710004) 赵红霞 高 滢

目的：研究全脑缺血再灌注后茶多酚对p38信号转导通路蛋白的表达及对大鼠海马CA1区细胞凋亡的影响，探讨其对脑缺血再灌注损伤的保护作用。方法：126只雄性健康清洁SD大鼠随机分为3组,缺血再灌注组(IR,n=42),假手术组(PO,n=42),茶多酚干预组(TP,n=42)。经典四血管阻塞法建立全脑缺血再灌注损伤模型, TP组给予腹腔注射茶多酚200 mg/kg,时间在全脑缺血再灌注结束之后，其余两组则给予等剂量生理盐水腹腔注入。各组均在再灌注后2、6、12、24、48、72h 处死大鼠,提取脑组织制备病理切片,免疫组化染色观察磷酸化p38蛋白的表达；HE染色观察海马CA1区神经元形态结构的改变；TUNEL染色计算阳性细胞凋亡指数。结果：脑缺血再灌注损伤后凋亡细胞在海马CA1区PO组少量表达,IR组显著表达(P<0.05),TP组凋亡细胞表达在各时间点介于IR组和PO组之间(P<0.05)；与PO组比较,IR组在再灌注后各时点p38蛋白表达显著增强(P<0.05),TP组较PO组表达增强但较IR组表达减弱(P<0.05)。结论：茶多酚可抑制大鼠全脑缺血/再灌注损伤时的p38蛋白活性,进而减少海马椎体细胞凋亡,对脑缺血/再灌注损伤具有保护作用。

丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)是真核生物细胞内重要的信号转导系统，参与细胞的生长、发育、分化和凋亡等一系列病理生理过程[1]。MAPK家族主要包括ERK,p38MAPK和JNK通路3个主要成员。实验结果显示,活化的磷酸化p38蛋白参与了机体免疫与应激反应过程中的细胞凋亡。在细胞凋亡发生后及时干预可明显减少由脑缺血后再灌注形成的继发损伤所致的细胞凋亡的发生。茶多酚(Tea-polyphenols,TP)是由绿茶中提取的具有超强抗氧化剂作用的物质,具有较强的清除人体自由基、抗癌、抗辐射、稳定心血管系统功能等作用[2]。本研究探索在临床麻醉手术中常见的脑缺血再灌注损伤后茶多酚对细胞凋亡的影响,为临床研究脑保护及保护机制提供帮助。

材料与方法

1 材 料 雄性清洁级 Sprague-Dawley 大鼠126只,鼠龄55～65d,体重250±30g，实验动物均在标准实验条件下饲养1周,术前禁食12h。茶多酚(购自美国Sigma公司),原位末端标记细胞凋亡试剂盒(购自美国Promega公司),SABC免疫组织化学试剂盒、DAB显色试剂盒和p38磷酸化抗兔多克隆抗体(由北京博奥森生物科技有限公司提供)。

2 方 法 ①动物分组：126只Sprague-Dawley 大鼠随机分为假手术组(PO组)，缺血/再灌注组(IR组)和茶多酚治疗组(TP组)。各组均按再灌注时间点的不同分为2h、6h、12h、24h、48h和72h 6个亚组,每个亚组7只动物。②模型制作及取材：实验动物采用经典4-VO法建立全脑缺血/再灌注损伤模型。手术第1日,IR组及TP组先用微电凝将双侧椎动脉凝断,缝合伤口后放入笼中；第2日,分离第1日凝断椎动脉大鼠的颈总动脉,然后用微动脉夹将双侧颈总动脉夹闭6min,颈总动脉夹闭后在实验光源下观察到大鼠瞳孔散大、嘴唇发绀、呼吸急促、眼球苍白等变化。若在颈总动脉夹闭2min内瞳孔不散大者予以剔除,不计入实验动物总数，然后重新纳入新的实验动物同前方法造模，归入剔除的组内。PO组模型制作时仅暴露出实验动物的颈总动脉及椎动脉,不凝断椎动脉和夹闭颈总动脉。再灌注结束后TP组给予腹腔注射茶多酚200mg/kg,其余各组注射等量的生理盐水。③HE染色及免疫组织化学SABC法染色：见参考文献[3]。④TUNEL法检测细胞凋亡：见参考文献[4]。

3 统计学方法 采用SPSS13.0软件包进行统计学处理，计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用方差分析及LSD-t检验,P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 HE染色 见图1。PO组海马CA1区约有3～4层椎体细胞,排列整齐,胞质淡红,胞核蓝染,核仁清晰。IR组镜下可见神经元数目明显减少,细胞浆呈嗜酸性变、细胞体深染、细胞膜及核膜皱缩、细胞核仁消失。而TP组大鼠海马CA1区神经元数目较缺血再灌注组多，较假手术组为少，且细胞形态改变较轻，正常神经元与缺血损伤后神经元交错分布。

2 磷酸化p38蛋白免疫组化结果 见图2，表1。镜下观察切片,在脑缺血再灌注敏感区磷酸化p38蛋白的表达在各组不同，且与再灌注损伤时间相关。在PO组，表达不明显，棕褐色阳性细胞较少，IR组棕褐色阳性磷酸化p38蛋白表达呈一定规律，即在再灌注结束后的2h开始微量表达,随着再灌注时间的延长，其表达较之前更明显，到再灌注后48～72h时，褐色阳性细胞数量最多，染色最明显，当达到顶峰后开始出现下降,这一结果经统计学检验具有统计学意义(P<0.05)。而茶多酚干预后，TP组各时间点褐色阳性细胞表达较PO组多而较IR少(P<0.05)。

表1 茶多酚治疗后各时点海马CA1区磷酸化p38蛋白阳性细胞率比较 ±s)

注：与PO组相比，★P<0.05；与IR组相比，▲P<0.05

3 TUNEL法检测细胞凋亡结果 见图3,表2。检测结果统计，凋亡细胞在各组分布不同，最多表达于IR组，且随着再灌注时间的不同，凋亡细胞表达呈先升高至高峰后又开始下降，高峰时间在再灌注后48h，凋亡细胞表达最少在PO组，而TP组凋亡细胞的表达介于IR组和PO组之间。

表2 茶多酚治疗后各时点海马CA1区椎体细胞凋亡指数比较±s)

注：与PO组相比,★P<0.05；与IR组相比,▲P<0.05

讨 论

众所周知,脑缺血/再灌注损伤后细胞死亡主要有坏死和凋亡两种形式,而坏死的发生较早,且呈瀑布式级联反应,因此,对于研究着来讲似乎无法干预，而凋亡的发生则较坏死发生滞后[5]。既往研究资料显示，在脑缺血再灌注后2～4d都可以观察到凋亡的发生,因此，针对凋亡的干预应该成为临床研究的重点。本实验结果显示，大鼠全脑缺血2～4h后,p38活性开始增高,3～4d后达到峰值。同时,细胞凋亡检测结果显示：脑缺血/再灌注损伤后，凋亡细胞在6h开始增多，24～48h达到高峰,72h开始下降。二者的发生在时间上具有一致性，且p38蛋白含量的高低与细胞凋亡程度呈正相关。这一结果表明,p38MAPK通路在脑缺血/再灌注损伤中起重要作用,即在细胞凋亡的早期即被激活而诱导和加重细胞凋亡的发生。

茶多酚是一种强效的天然抗氧化剂,具有降压、降脂、抗氧化等临床作用,在人群免疫及保健方面发挥重要作用,本实验还发现,茶多酚在全脑缺血再灌注损伤后抑制细胞凋亡方面起重要作用，其抗细胞凋亡的机制可能主要与抑制细胞膜上的海人藻酸受体和N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体所介导的Ca2+内流有关[6]。其次,茶多酚有强大的抗氧化作用,可以清除细胞内所产生的氧自由基[7]。

通过本实验研究，得出以下结论：茶多酚可以通过多种作用机制改善脑缺血/再灌注后所致的细胞损伤，减轻细胞凋亡的发生，其中，最可能的机制则与抑制p38MAPK通路的活性相关，从而为临床治疗常见的休克，呼吸心跳骤停等提供新的思路。但基于目前的研究现状，还无法达到这一目的，期待在今后的研究中有更佳的发现。

[1] 粟建新.茶多酚分对大鼠皮层神经元的保护作用研究[J].中国现代药物应用，2014，8(1)：236-237.

[2] 李 军，辛 勤，杨 雁.绿茶多酚药理作用的研究进展[J].中国热带医学，2014，14(1)：128-130.

[3] 王 智,薛荣亮,赵红霞,等.姜黄素对缺血/再灌注损伤大鼠APE/Ref-1表达及细胞凋亡的影响[J].山东医学杂志,2013,37：1-4.

[4] 王 智,薛荣亮,赵红霞,等.依达拉奉对大鼠XRCC1和细胞凋亡的影响[J].实用医药杂志,2012,15(9)：537-540.

[5] 赵保路.茶多酚保护脑神经防止帕金森病损伤作用及其分子机理[J].生物化学与生物物理进展,2008, 35(7)：735-743.

[6] 刘军权,陈复兴,巩新建,等.茶多酚增强T淋巴细胞杀伤肿瘤细胞的作用研究[J].陕西医学杂志,2010,39(4)：355-357,367.

[7] 薜荣亮，纪 娜，高 静，等.茶多酚对大鼠全脑缺血再灌注损伤的影响[J].中华麻醉学杂志，2011，31(9)：1117-1119．

(收稿：2014-10-13)

*国家自然科学基金资助项目(30571790)

脑 再灌注损伤 细胞凋亡 p38有丝分裂原激活蛋白激酶 @茶多酚

R743.3

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10.3969/j.issn.1000-7377.2015.06.005