MMP-2、MMP-9在口腔黏膜白斑中表达的研究*

苏颖颖 杜启涛 张茜 曲哲

白斑属于癌前病变，已有报道其进展为鳞状细胞癌与上皮异常增生的严重程度有直接的关系[1]，但目前还没有一个明确的生物学指标来评估这一恶变[2]。基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）是一种Zn2+依赖性的中性蛋白水解酶，可降解和塑造细胞外基质（extracellular matrix，ECM），维持细胞外基质的动态平衡，参与恶性肿瘤的发生及侵袭过程[3-4]。目前MMP在恶性肿瘤侵袭转移方面的研究多有报道，而在白斑及上皮不同增生程度间表达的研究较少。本文应用免疫组织化学方法检测MMP-2、MMP-9在正常口腔黏膜、白斑上皮单纯性增生和异常增生中的表达情况，以期对两者在白斑发生发展中的变化做初步的研究。

1 材料与方法

1.1 病例来源及选择标准 本实验选取的标本均为2008-2014年间大连市口腔医院颌面外科的手术标本，所有患者均知情同意。其中正常组15例为黏液囊肿活检标本中的正常口腔上皮组织。由2位高年资病理医生重新复核切片将白斑分为两组：白斑上皮单纯增生组31例和白斑上皮异常增生组35例。所有标本均经10%中性福尔马林固定，取材后脱水制成石蜡，常规HE染色。实验均设阳性对照和阴性对照，血管内皮细胞的阳性表达可作为内对照参考[2]。

1.2 临床病理特征 白斑上皮单纯性增生31例，其中男19例，女12例，白斑上皮异常增生35例，其中男18例，女17例，见表1。

表1 白斑上皮单纯性增生和白斑上皮异常增生的发生部位

1.3 主要试剂及方法 兔抗人MMP-2多克隆抗体（即用型），兔抗人MMP-9单克隆抗体（1：100），均由北京中杉金桥公司购得。采用免疫组化SP染色法。

1.4 结果判定 MMP-2和MMP-9均以胞浆呈棕褐色为阳性。根据综合染色强度和阳性细胞占总细胞数的百分比进行评价[5]：由两人双盲法观察切片，染色阴性0分，染色弱1分，染色清晰2分，染色强3分；阳性细胞数<5%为1分，阳性细胞数5%~25%为2分，阳性细胞数26%~50%为3分，阳性细胞数>50%为4分。两项之和≥4为阳性表达。

1.5 统计学处理 MMP-2和MMP-9的免疫组化结果和各自病理间的关系应用SPSS 12.0软件进行 字2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MMP-2阳性表达在上皮细胞的胞浆中，主要分布于基底细胞层中，也可见棘细胞层中。三组阳性率表达情况见表2，三组比较差异无统计学意义（P>0.05）。此外，在上皮下结缔组织中也发现了MMP-2的表达，以成纤维细胞表达居多，也可见炎细胞及血管内皮细胞中，成纤维细胞的阳性表达率见表3，三组比较差异无统计学意义（P>0.05）。

2.2 MMP-9阳性表达位于上皮细胞的胞浆中，多见于棘细胞层中。三组的阳性表达率见表4，其中白斑异常增生组较正常组和单纯增生组比较差异有统计学意义（P<0.05）。在上皮下结缔组织中也发现了MMP-9的阳性表达，以聚集在成纤维细胞、炎细胞、血管周围表达居多。成纤维细胞的阳性表达见表5，其中异常增生组的阳性率较正常组及单纯增生组比较差异有统计学意义（P<0.05）。

表2 MMP-2在上皮内表达的免疫组化染色结果

表3 MMP-2在上皮下表达的免疫组化染色结果

表4 MMP-9上皮内免疫组化染色结果

表5 MMP-9上皮下免疫组化染色结果

3 讨论

口腔癌的发病机理是一个多步骤、多因素的过程，其中包括从正常口腔黏膜到单纯增生、异常增生、原位癌最后发展成浸润癌的一个连续的病理过程[6]。白斑是口腔黏膜癌前病变中的一种，癌前病变是指转变为鳞状细胞癌的可能性增加的发生改变的上皮，这种上皮异常增生的程度越重，后期发展成癌的可能性就越大[7]。因此，有学者将无异常增生、可疑异常增生和轻度异常增生归为低危险性；将中、重度异常增生和原位癌归为高危险性[8]。

MMP-2、9是MMPs中重要的蛋白水解酶，主要降解Ⅳ型胶原蛋白。MMP-2基因位于人类染色体16q21，由12个内含子和13个外显子组成，结构基因总长度为27 kb，分子量为72 KD，MMP-2可由体内多种细胞合成和分泌，包括成纤维细胞、内皮细胞、浆细胞、星形细胞、小胶质细胞、神经细胞、巨噬细胞、嗜酸粒细胞和中性粒细胞等[9]。MMP-9基因定位于20号染色体，分子量为92 KD，主要由角质形成细胞、中性粒细胞、单核细胞、血管内皮细胞、平滑肌细胞等多种细胞分泌[10-11]。MMP-2、9在正常组织表达较少，在肿瘤细胞中表达增加[12]，可降解细胞外基质，并与基底膜中IV型胶原的丧失有关，在细胞的浸润和转移中发挥重要的作用[13]。有研究显示MMP-2、9可由EMMPRIN（细胞外基质金属蛋白酶诱导因子）调控，它可在肿瘤表面刺激邻近成纤维细胞合成MMPs[14]。实验结果显示，上皮细胞与上皮下成纤维细胞均有MMP-2、9的阳性表达，从正常黏膜到异常增生，阳性表达率增加。这与以往研究结果相似[15-16]。推测，随着上皮异常增生的程度增加，上皮内和上皮下的MMP分泌增加，共同作用于基底膜，使基底膜的连续性及完整性逐步降低，细胞的侵袭能力增加，形成恶性肿瘤的危险性增加。但本研究中MMP-2的阳性率在三组间无显著差异可能与样本量不足，或使用MMP-2多克隆抗体有关。MMP-9在上皮内和上皮下成纤维细胞中的阳性率在异常增生组中明显高于正常组和单纯增生组，且差异具有统计学意义（P<0.05），推测其参与了白斑的发生发展过程。但因白斑终究为基底层上皮内细胞学及结构的改变，且尚未突破基底膜，有实验研究不论是MMP或是基底膜中的IV型胶原在白斑中仅有量变的过程，尚未达到质变，当发展成鳞癌时两者才发生了较明显的变化[13]。此外，本实验数据显示，正常口腔黏膜与单纯增生组的阳性率差异不大，猜测单纯增生可能仅仅是因为吸烟或摩擦引起的上皮增生，去除病因有可能减轻病变。进一步研究还需扩大样本量，并增加对原位癌及鳞癌的观察及基因学的检测。

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