长链非编码RNA-HOTAIR与乳腺癌腋窝淋巴结转移相关性研究

王昌亮 王礼泉 林明臻 孙香莲 翟升永

长链非编码RNA（large intervening non-coding RNA，lncRNA）是一类转录本长度超过200nt的RNA分子，他们本身并不编码蛋白质，而常以RNA的形式调控基因的表达，包括表观遗传学调控，转录调控，转录后调控等[1-2]。最初研究认为lncRNA是RNA聚合酶Ⅱ的转录副产物[3]，然而近年来的研究提示其生物学功能广泛且参与多种重要的调控过程如染色质修饰、转录激活以及核内运输等等。HOTAIR是lncRNA的成员之一，与肿瘤发生发展关系密切[4-5]，其在乳腺癌中的研究限于对某些蛋白的表达调控[6]。本实验研究探索HOTAIR在乳腺癌组织及前哨淋巴结中的表达情况，为乳腺肿瘤的基因治疗提供新策略。结合临床病理资料分析，指导治疗及预测预后。

1 材料与方法

1.1 实验对象入组标准及标本来源

1.1.1 实验对象入组标准 所有入组患者均签署知情同意书，实验研究符合伦理学原则。收集潍坊市人民医院乳腺外科2013年6-年12月住院患者，行乳房手术+前哨淋巴结活检术，术前穿刺病理诊断为乳腺浸润性癌，取乳腺癌组织、癌旁组织，癌旁组织选取乳腺非同一象限经病理证实为正常乳腺组织。前哨淋巴结（sentinel lymph node，SLN）探测仪结合亚甲蓝染料检出SLN≥2枚且术中冰冻病理示SLN有转移的患者入组，进而行常规腋窝淋巴结（Axillary lymph node，ALN）清扫。标本来源均为女性，年龄32~51岁，平均42.2岁。术后常规病理证实为浸润性导管癌，SLN转移数目不少于2枚，ALN转移率低于100%，获得SLN（+）组10例，ALN（-）组10例，乳腺癌组织组10例，癌旁组织组10例。记录患者年龄、前哨淋巴结（SLN）数目、腋窝淋巴结（ALN）数目、雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）、C-erbB-2、P53以及ki-67。淋巴结转移数分组采用N1、N2、N3（无N0患者）；淋巴结转移率（10%，10%~50%，50%）；ki-67表达（14%，14%~75%，75%）。

1.1.2 标本处理及保存 取前哨淋巴结，纵向等大剖开，一半冰冻检查，另一半RNAlater solution（购自AMBION公司）保存，留作提取RNA使用。冰冻检查示有癌组织转移，则另一半继续进行实验操作。腋窝淋巴结组取未转移淋巴结，剖开保存。癌组织、癌旁组织相同实验处理。所有标本均为新鲜标本，简单切碎组织样本，任何一边的最大厚度不超过0.5 cm，RNAlater液5倍于组织碎块并完全浸没，-80 ℃长期保存。入组病例临床病理资料见表1。

表1 入组患者临床病理资料

1.2 总RNA提取及质量判断

1.2.1 总RNA提取 异硫氰酸胍-苯酚（Trizol， 购自INVITROGEN公司）法提取总RNA：裂解细胞获得核酸，利用DNA和RNA在特定pH时溶解度不同，通过有机溶剂抽提沉淀RNA。-80 ℃冰箱保存组织样本室温下解冻，组织块放入处理好的EP管称重，一次提取的组织块重量在0.05~0.1 g之间，并做好记录。进行RNA提取，并防止DNA污染。

1.2.2 RNA质量判断 分光光度仪进行RNA定量，计算OD260/OD280比值，范围在1.8~2.0为满意纯度。记录RNA浓度，总体RNA浓度范围（2.1946±0.7765）μg/μL。RNA电泳符合标准即：有清晰地18S、28S条带，RNA无降解，且肉眼观察28S条带亮度是18S条带亮度的1~2倍，进行RNA逆转录。

1.3 RNA逆转录、lncRNA-HOTAIR的实时荧光定量

1.3.1 实时荧光定量反应试剂及引物准备 HOTAIR序 列：（Forward）GGGGCTTCCTTGCTCTTCTTATC；（Reverse）GGTAGAAAAAGCAACCACGAAGC，β-ACTIN（内参）序列：（Forward）CCTGTACGCCAACACAGTGC；（Reverse）ATACTCCTGCTTGCTGATCC。逆转录反应试剂盒、荧光定量PCR试剂盒以及引物序列均购自INVITROGEN公司。使用美国ABI公司的实时荧光定量仪：ABI-7500HT。

1.3.2 逆转录及实时荧光定量反应 （1）采用INVITROGEN公司的逆转录反应试剂盒（5×RT Reaction Buffer、Enzymes mix、Rnase-free ddH2O），低温解冻，逆转录反应溶液振荡混匀后离心，加模板RNA到混合液中混匀，离心收集管壁残留液体，42 ℃水浴反应1小时95 ℃水浴5分钟完成逆转录。逆转录产物4℃保存进行RT-PCR。（2）使用INVITROGEN公司的荧光定量PCR试剂盒（SYBR Green master mix、PCR primer mix、ROX Reference Dye），进行荧光定量，每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，监测PCR产物量的变化，得到模板RNA逆转录后PCR扩增曲线图三个阶段：基线期、对数期和平台期。对荧光曲线的指数扩增阶段进行定量分析。

1.4 统计学处理 采用美国ABI公司SDS 1.4软件处理实验结果。统计学分析采用t检验、Spearman等级相关分析等进行处理。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 实时荧光定量检测长链非编码RNA-HOTAIR在各组中的表达情况。待测HOTAIR量通过软件计算以-△△CT表示相对表达量。各组中HOTAIR表达情况见表2。

表2 HOTAIR在各组中的相对表达量

2.2 前哨淋巴结（SLN）中HOTAIR表达情况与患者临床病理指标关系分析 分析实时荧光定量结果与临床病理指标关系提示：HOTAIR与淋巴结转移率存在相关性，表现为淋巴结转移率高，HOTAIR表达升高（相关系数r=0.65；P=0.03）；另外ki-67蛋白高表达癌组织，对应SLN中HOTAIR表达量越高，呈直线相关（相关系数r=0.80；P<0.01）。而HOTAIR表达量与淋巴结转移数目、年龄、ER、PR、C-erbB-2以及P53无明显相关性。资料见表3。

表3 SLN中HOTAIR表达情况与临床病理指标间的关系

3 讨论

长链非编码RNA HOTAIR是HoxC基因簇的一条反义链，是一个长度为2.2 kb的基因，定位在哺乳动物12q13.13上HOXC位点，不编码任何蛋白质。目前HOTAIR被人们所认识的作用机制是特异性结合多梳抑制复合体2（PRC2），HOTAIR可至少连接两个不同的组蛋白修饰复合物，从而充当一个脚手架的作用，如其5’端区连接PRC2 复合物，负责H3K27 的甲基化；3’区连接LSD1（组蛋白赖氨酸去甲基化酶）介导H3K4me2 的去甲基化。抑制相关基因的表达，使得染色体特定区域发生甲基化，引发异染色质形成或基因沉默而致病[7]。研究发现HOTAIR通过在上皮-间质转化（EMT）过程中调控Snail蛋白的表达，对肿瘤细胞增殖、凋亡作用显著[6，8]。越来越多的LncRNA被证明在细胞水平和分子遗传学水平具有相应的功能，包括剂量补偿效应、参与基因组印记过程、组蛋白修饰、染色质重构、细胞分化、细胞结构的完善、细胞周期的调控、细胞内物质的运输、干细胞的程序再编以及热休克反应，作为微小RNA（miRNA）的前体等[9]。LncRNA的这些作用已引起人们的广泛关注，其中既有顺式调控作用，又有反式调控作用的HOTAIR在癌症中异常表达，已成为癌症方面非编码RNA研究的一个新的热点，但作用机制尚不十分清楚[10]。

本实验研究中，HOTAIR在前哨淋巴结组以及癌组织组中表达量异常升高，提示HOTAIR在恶性肿瘤细胞的侵袭转移发生发展方面关系密切。

Gupta等[9，11-13]研究发现HOTAIR在乳腺癌远处转移灶中表达显著升高，并认为HOTAIR是预测肿瘤转移和预后的重要指标。本实验研究中前哨淋巴结HOTAIR异常高表达，提示其作为乳腺癌基因治疗新靶点的可行性。可为前哨淋巴结阳性患者，术后辅助化疗同时，给予基因靶向治疗。临床病理资料分析显示HOTAIR在影响患者术后治疗方案选择、预测预后有一定作用。HOTAIR表达量与腋窝淋巴结转移率有相同的变化趋势，表现为ALN%越高，HOTAIR表达量增加。ki-67反应恶性肿瘤增殖活性大小。乳腺癌中ki-67也作为预后指标之一，ki-67阳性表达越高，预示细胞增殖活跃，侵袭转移几率高，预后差[14]。实验中HOTAIR基因与ki-67蛋白表达呈正相关，与文献报道相似[15]。但其他临床病理指标未显示明显相关，需扩大样本量进一步研究。

[1] Kapranov P，Cheng J，Dike S，et al.RNA maps reveal new RNA classes and a possible function for pervasive transcription[J]. Science，2007，316（5830）：1484-1488.

[2] Cai B， Song X Q， Cai J P， et al. HOTAIR： a cancer-related long noncoding RNA[J].Neoplasma， 2014， 61（4）：379-391.

[3] Khalil A M， Guttman M， Huarte M， et al. Many human large intergenic noncoding RNAs associate with chromatin-modifying complexes and affect gene expression[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences， 2009， 106（28）： 11 667-11 672.

[4] Tsai M C， Manor O， Wan Y， et al. Long noncoding RNA[J].Science，2010，329（5992）：689-693.

[5] Yao Y， Li J， Wang L. Large intervening Non-Coding RNA HOTAIR is an indicator of poor prognosis and a therapeutic target in human cancers [J]. Int J Mol Sci， 2014，15（10）：18 985-18 999.

[6]杨韬， 李俊堂， 王丽娟， 等 .干涉 lncRNAsHOTAIR 对人乳腺癌细胞 MDA-MB-231 的影响[J]. 细胞与分子免疫学杂志， 2012， 28（1）： 97-98.

[7] Spitale R C， Tsai M C， Chang H Y. RNA templating the epigenome：Long noncoding RNAs as molecular scaffolds[J].Epigenetics，2011，6（5）：539-543.

[8] Zhang S， Chen S， Yang G， et al. Long noncoding RNA HOTAIR as an independent prognostic marker in cancer： a meta-analysis [J].Plos One，2014，9（8）：e105 538.

[9] Gupta R A， Shah N， Wang K C， et al. Long non-coding RNA HOTAIR reprograms chromatin state to promote cancer metastasis[J].Nature，2010，464（7291）：1071-1076.

[10] Zhang J， Zhang P， Wang L， et al. Long non-coding RNA HOTAIR in carcinogenesis and metastasis[J].Acta Biochim Biophys Sin（Shanghai），2014，46（1）：1-5.

[11] Zhuang Y， Nguyen H T， Burow M E， et al. Elevated expression of long intergenic non-coding RNA HOTAIR in a basal-like variant of MCF-7 breast cancer cells[J]. Mol Carcinog，2014， 2012， 46（34）：22237：

[12] Su X， Malouf G G， Chen Y， et al. Comprehensive analysis of long non-coding RNAs in human breast cancer clinical subtypes [J].Oncotarget， 2014，42（8）： 29-36.

[13] Serensen K P， Thomassen M， Tan Q， et al. Long non-coding RNA HOTAIR is an independent prognostic marker of metastasis in estrogen receptor-positive primary breast cancer[J].Breast cancer Res Treat，2013，142（3）：529-536.

[14] De Azambuja E， Cardoso F， De Castro G， et al. Ki-67 as prognostic marker in early breast cancer： a meta-analysis of published studies involving 12 155 patients[J]. British journal of cancer， 2007， 96（10）： 1504-1513.

[15]王剑. 长链非编码RNA HOTAIR和HOTTIP在乳腺癌中的表达研究[D].昆明：昆明医科大学硕士学位论文，2013.