激活TLR5和NLRC4通路的重组鞭毛素蛋白对不同乳腺癌细胞系增殖的抑制作用①

李 伟 卓召振 李荣辉 袁 军

(贵州省人民医院中心实验室，贵阳550002)

激活TLR5和NLRC4通路的重组鞭毛素蛋白对不同乳腺癌细胞系增殖的抑制作用①

李 伟 卓召振②③李荣辉③袁 军③

(贵州省人民医院中心实验室，贵阳550002)

目的：探究激活TLR5和NLRC4通路的重组鞭毛素蛋白对不同乳腺癌细胞系增殖的抑制作用。方法：表达和纯化重组鞭毛素蛋白即全长鞭毛素蛋白FliC(同时激活TLR5和NLRC4两条通路)、FliCΔ90-97(不能激活TLR5通路)、FliC-L3A(不能激活NLRC4通路)和FliCΔ90-97:L3A(两条通路都不激活)。用不同浓度的重组鞭毛素蛋白刺激MCF-7细胞和MDA-MB-231细胞，72 h后，利用CCK8法检测其对肿瘤细胞增殖的影响，并计算抑制率。软琼脂形成实验：每孔细胞数为1 000个MCF-7细胞铺于6孔板中，重组鞭毛素蛋白浓度为1 μg/ml，培养14 d后，结晶紫染色，显微镜下计数克隆数，计算克隆形成率。结果：四种鞭毛素蛋白在0.1 μg/ml的浓度刺激下，对MCF-7细胞的抑制率达到30%,FliCΔ90-97对MCF-7的抑制作用是剂量依赖的。在1 μg/ml时单独激活TLR5的FliC-L3A鞭毛素蛋白的抑制率高于全长的FliC和单独激活NLRC4的FliCΔ90-97。FliCΔ90-97:L3A也对MCF-7细胞有抑制作用。四种鞭毛素蛋白对MDA-MB-231细胞在加转染试剂之后才表现出抑制效应。结论：鞭毛素蛋白可以抑制乳腺癌细胞MCF-7 和MDA-MB-231细胞的增殖，其机制可能是由于分别激活胞膜和胞内的除TLR5和 NLRC4以外的其他通路。

鞭毛素蛋白；TLR5；NLRC4；乳腺癌细胞

乳腺癌居女性恶性肿瘤第一位，已成为严重威胁女性健康和生命的杀手，对乳腺癌的治疗同其他肿瘤一样尚面临许多难题。越来越多的证据表明，TLRs在癌症进展中起着重要作用[1-4]。TLR4能够保护肿瘤细胞抵御免疫攻击，促进肿瘤生长[5]，而激活TLR3则能够促进乳腺癌和黑色素瘤的增殖[6]。因此，不同的肿瘤细胞中的TLRs的功能和生物学活性是不同的。

鞭毛素是细菌鞭毛的重要构成组件，也是一种重要的PAMPs。鞭毛素蛋白作为TLR5的天然配体，激活TLR5介导的信号通路，启动促炎基因的表达。同时可以被胞内的NAIP5/NLRC4识别，能够激活Caspase-1并释放成熟的IL-1β和IL-18，同时引起细胞的凋亡。我们先前的研究发现不同乳腺癌细胞系都表达TLR5和NLRC4，MCF-7细胞TLR5和NLRC4表达高于其他乳腺癌细胞系。而且文献报道鞭毛素蛋白可以通过激活乳腺癌细胞上的TLR5抑制肿瘤细胞的增殖[7]，NLRC4炎症小体在结直肠癌的发生发展中起重要作用[8]。鞭毛素蛋白能够通过TLR5通路的激活增强肿瘤特异性的CD8+T细胞应答[9]。然而有研究发现鞭毛素蛋白注射体内可以抑制也可以促进肿瘤的生长[10,11]。那么鞭毛素抑制乳腺癌细胞增殖是否只通过TLR5通路？NLRC4通路的激活对TLR5通路介导的肿瘤抑制作用是否有影响？目前并无相关研究报道。

本研究利用重组鞭毛素蛋白同时或者单独激活TLR5和NLRC4通路，探讨了重组鞭毛素蛋白通过TLR5和NLRC4通路对乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231的抑制作用，为深入了解鞭毛素蛋白对不同乳腺癌细胞的抑制机制和利用鞭毛素蛋白进行抗肿瘤治疗具有非常重要的意义。

1 材料与方法

1.1实验试剂、仪器和细胞系 CCK8细胞增殖检测试剂盒(日本同仁)；DMEM 培养基(Gibco)；氨苄青霉素和链霉素(北京索莱宝公司)；胎牛血清(杭州四季青公司)；0.25%胰蛋白酶(Hyclone)；MDA-MB-231和MCF-7细胞购自武汉博士德公司，表达菌株FliC、FliC-L3A、FliCΔ90-97和FliCΔ90-97:L3A由中国科学院武汉病毒所鄢慧民研究员惠赠。

1.2实验方法

1.2.1细胞培养 细胞培养：MDA-MB-231、MCF-7和MDA-MB-435细胞培养于含10% 胎牛血清的DMEM完全培养基中，每隔3～5 d进行传代培养，待细胞进入对数生长期时，收获细胞备用。

1.2.2重组鞭毛素蛋白的表达和纯化及活性检测 方法见参考文献[12]。

1.2.3克隆形成实验 用去离子水分别配制1.2%和0.7%两个浓度的低溶点琼脂糖溶液，高压灭菌后，置于40℃中不会凝固。按1∶1比例使1.2%的琼脂糖和2×DMEM培养基(含有2×抗生素和20%的小牛血清)混合后，取3 ml混合液注入直径6 cm平皿中，冷却凝固可作底层琼脂置CO2温箱中备用。按1∶1比例在无菌试管中混合0.7%的琼脂糖和2×DMEM培养基，再向管中加入0.2 ml的细胞悬液，并加入鞭毛素蛋白，使其终浓度为1 μg/ml，充分混匀，注入铺有1.2%琼脂糖底层平皿中，形成双琼脂层，待上层琼脂凝固后，置入37℃ 5%CO2温箱中培养14 d。结晶紫染色后，把平皿放置在倒置显微镜下，观察细胞克隆数，计算形成率。

1.2.4CCK8检测细胞增殖 梯度配制鞭毛素蛋白，使其浓度为0.1、1、10 μg/ml，梯度稀释时候要充分涡旋混匀，注意无菌操作。

充分吹散细胞，混匀，细胞计数板计数，调整细胞数至2.5×104ml-1，然后相应鞭毛素蛋白孔加入100 μl，即每孔细胞数为2 500个，加四种重组鞭毛素蛋白(1 μg/ml)刺激，培养70 h，CCK8法检测细胞增殖情况。37℃，5%CO2培养70 h吸出多余培养基，使剩余体积为100 μl。然后每孔加入10 μl的CCK8试剂，继续培养4 h。测定450 nm每孔OD值，根据公式计算抑制率。抑制率(%)=(未处理照组-空白)-(处理组-空白)/(未处理组-空白)×100%。

1.3统计学处理 实验结果用GraphPad Prism 5.0软件进行统计处理。所得结果的比较采用One-way ANOVA和T检验共同分析。以P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1CCK8法检测不同浓度的重组鞭毛素蛋白对MCF-7细胞的抑制作用 四种鞭毛素蛋白在0.1 μg/ml的浓度下，对MCF-7细胞的抑制率达到30%,FliCΔ90-97对MCF-7的抑制作用是剂量依赖的。在1 μg/ml时单独激活TLR5的FliC-L3A鞭毛素蛋白的抑制率高于全长的FliC和单独激活NLRC4的FliCΔ90-97。虽然FliCΔ90-97：L3A不激活TLR5和NLRC4两条通路，但是对乳腺癌MCF-7细胞仍有抑制作用(图1)。

2.2软琼脂克隆形成实验检测重组鞭毛素蛋白对MCF-7细胞的抑制作用 软琼脂克隆形成实验中，全长FliC对MCF-7的抑制作用最明显，克隆形成率仅为3.3%，对照组克隆形成率为7.8%，差异有统计学意义(P<0.01)。其次是FliC-L3A和FliCΔ90-97。FliCΔ90-97：L3A也对MCF-7细胞有抑制作用(图2 A、B)。

2.3CCK8法检测不同浓度的重组鞭毛素蛋白对MDA-MB-231细胞的直接抑制作用 无转染试剂处理，四种重组鞭毛素蛋白与MDA-MB-231细胞共培养70 h，抑制率与对照组相比，差异无统计学意义(图3)。

2.4加入转染试剂后鞭毛素蛋白抑制MDA-MB-231细胞的增殖 我们先前的研究发现MDA-MB-231细胞TLR5在胞质内，对鞭毛素刺激无反应。因此，本实验加入转染试剂Lipo2000，使重组鞭毛素蛋白转入细胞内。研究发现，当加入转染试剂后，各重组鞭毛素蛋白均对MDA-MB-231出现很明显的抑制作用，而且呈浓度依赖性。10 μg/ml浓度的FliC和FliCΔ90-97对MDA-MB-231细胞的抑制率均高于0.1 μg/ml和1 μg/ml(P<0.001)。在相同浓度下,各重组鞭毛素蛋白对MDA-MB-231细胞的抑制率无明显差异(图4)。

图1 重组鞭毛素蛋白抑制MCF-7细胞的增殖Fig.1 Recombinant flagellin inhibit proliferation of MCF-7

图2 MCF-7细胞软琼脂克隆形成实验

图3 MDA-MB-231乳腺癌细胞对鞭毛素蛋白无反应Fig.3 MDA-MB-231 breast cancer cells has no response to flagellin

图4 加入转染试剂后鞭毛素蛋白抑制MDA-MB-231细胞的增殖Fig.4 Recombinant flagellin inhibit prolifration of MDA-MB-231 after adding transfection reagent Lipo2000Note: ***.P<0.001.

3 讨论

鞭毛素蛋白是TLR5和NLRC4受体的配体，能够激活机体的先天免疫系统来抵御病原菌的入侵，而最近的研究表明TLR5和NLRC4受体的激活可能影响着肿瘤的形成和发展。先前的研究表明TLR5激动剂鞭毛素蛋白可能具有直接抑制肿瘤的功能[13,14]，鞭毛素蛋白和表达鞭毛蛋白的细菌在小鼠模型中表现了其抗肿瘤效果。目前，对鞭毛素蛋白是否只通过TLR5通路抑制不同乳腺癌细胞系增殖以及NLRC4通路的激活对TLR5通路介导的肿瘤抑制作用是否有影响并不十分清楚。

我们先前的研究已经发现了不同乳腺癌细胞系都表达TLR5和NLRC4受体，但是表达部位和表达水平存在差异，其中MCF-7细胞系中TLR5和NLRC4受体表达高于其他细胞系。本研究通过利用分别激活TLR5和NLRC4通路的重组鞭毛素蛋白刺激不同的乳腺癌细胞系，来探讨这两条通路的激活对乳腺癌细胞系的直接抑制作用的差异。采用CCK8检测细胞增殖情况发现，在MCF-7细胞四种重组鞭毛素蛋白均可以抑制MCF-7细胞的增殖，四种蛋白在相同浓度条件下抑制率接近。

MDA-MB-231细胞对鞭毛素蛋白直接刺激没有反应，但是在转染试剂Lipo2000存在下，四种鞭毛素蛋白均可以对其产生抑制效应，且呈现浓度依赖性。而重组鞭毛素蛋白可以直接抑制MCF-7细胞的增殖，这可能是由于MCF-7细胞系中TLR5受体在胞浆和胞膜上均有表达，而MDA-MB-231细胞系中只在胞浆中表达。重组鞭毛素蛋白对乳腺癌细胞的抑制情况跟TLR5和NLRC4通路的激活没有明显的相关性，所以可能其抑制效应除了TLR5和NLRC4的激活之外，还存在其他效应机制。这与之前文献报道的鞭毛素蛋白通过TLR5信号通路抑制乳腺癌并不完全一致。

那么，除了TLR5和NLRC4通路外是否还存在其他的通路？鞭毛素蛋白高变区和保守区在抑制乳腺癌细胞系增殖中是否存在差异？我们需要通过进一步的实验探讨鞭毛素蛋白抑制乳腺癌细胞系增殖的机制。

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[收稿2016-12-28]

(编辑 张晓舟)

ImpactofTLR5andNLRC4activationonproliferationofdifferentbreastcancercelllines

LIWei,ZHUOZhao-Zhen,LIRong-Hui,YUANJun.CentralLaboratory,GuizhouProvincialPeople′sHospital,Guiyang550002，China

Objective:To explore the impact of TLR5 and NLRC4 activation on the proliferation of different breast cancer cell lines,MCF-7 and MDA-MB-231.Methods:Induction,expression,purification and identification of recombiant flagellin,including FliC (activating both TLR5 and NLRC4),FliCΔ90-97(unable to activate TLR5),FliC-L3A (unable to activate NLRC4),FliCΔ90-97:L3A (unable to activate both TLR5 and NLRC4).Using different concentration of recombinant flagellin to stimulate MCF-7 and MDA-MB-231 cell lines,72 h later,the proliferation of tumor cells were detected with CCK8.We also used soft AGAR forming experiments to detect the inhibition ratio of recombinant flagellin on breast cancer cell lines.Briefly,1 000 cells were plated in the 6-well plate,then stimulated with 1 μg/ml recombinant flagellin,14 days later,the number of cloning were counted after crystal violet staining.Results:After stimulation with four recombinant flagellins at the concentration of 0.1 μg/ml,the inhibition ratio on MCF-7 reached 30%,and FliCΔ90-97 were dose-dependent on the inhibition of MCF-7 proliferation.At the concentration of 1 μg/ml,FliC-L3A which only activated TLR5 showed stronger inhibition ratio than FliC.FliCΔ90-97:L3A which did not activate both TLR5 and NLRC4 also inhibited the proliferation of MCF-7.After adding transfection reagent,four recombinant flagellins showed inhibition effect on MDA-MB-231.Conclusion:Flagellin can inhibit the proliferation of MCF-7 and MDA-MB-231,and the mechanism of inhibition on the proliferation were not TLR5 and NLRC4 pathway dependent.There might exist new mechanisms to explain this phenomenon.

Flagellin;TLR5;NLRC4;Breast cancer cell

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.06.013

①本文受贵州省卫计委科学技术基金项目(gzwjkj2015-1-020)、贵州省科技厅联合基金(黔科合LH字[2015]7167号)、贵州省科技厅科学基金(黔科合基础[2016]1093)和贵州省人民医院博士基金(GZSYBS[2015]11号)资助。

②并列第一作者。

③贵州省人民医院检验科，贵阳550002。

李 伟(1983年-)，男，博士，主要从事肿瘤免疫方面的研究，E-mail:lwcy2010@yeah.net。

及指导教师：袁 军(1970年-)，女，博士，教授，主要从事器官移植和肿瘤免疫方面的研究，E-mail：junyuan99430@163.com。

R730.5

A

1000-484X(2017)06-0869-04