基于高效液相特征图谱的桔梗标准汤剂质量标准研究*

★邓杏好 林明越 谭梅英（.佛山市顺德区北滘医院 广东 佛山 58；.佛山市中医院 广东 佛山 58000；.广东省第二中医院/广东省中医药工程技术研究院 广州 50095）

桔梗（platycodon grandiflorum（Jacq.）A.DC.），具有宣肺、祛痰、利咽、排脓之功效，临床上常用其与其它药味组方或以提取物用于祛痰、抗炎、抗肿瘤、镇痛等。桔梗含有多种化学成分，文献报道显示，桔梗总皂苷对A549 肺移植瘤组织生长有较好抑制作用，可能通过下调移植瘤组织STAT2 蛋白表达来抑制瘤组织的生长［1-4］。桔梗提取物、总皂苷等有效部位、现代化剂型的研发，促进了功效导向的现代化开发。在此基础上，将桔梗开发为中药标准汤剂，可以增强使用的便利性，质量的均一性，提高用药效率［5］。

目前为止，对桔梗的质量标准评价，主要采用薄层色谱鉴别和高效液相色谱含量测定及指纹图谱研究。标准汤剂系采用规范化工艺进行提取和制备的固态中药汤剂，出于使用需要，标准汤剂主要采用水或一定比例乙醇等对人体较为安全的溶剂进行提取，与指纹图谱研究中制备供试品的溶剂存在较大区别，故在制备过程中，仍需要对中药标准汤剂进行指纹图谱或者特征图谱研究［6-8］。

1 仪器和材料

高效液相色谱（HPLC）分析采用Waters 2695高效液相色谱仪（美国），配备DAD检测器；色谱柱为SUPERIOREX ODS C18（规格：4.6mm×250mm，5μm）（日本）。桔梗皂苷D对照品均购自中国食品药品检定研究院（中国）。HPLC分析所用乙腈为色谱纯，购自Merck（德国）；其余试剂均为分析纯，购自广州化学试剂厂（中国）。实验所用纯净水购自屈臣氏公司（中国）。桔梗药材购自本地药材市场。

2 方法与结果

2.1 HPLC条件 流动相采用乙腈-0.2%甲酸水溶液（v/v），乙腈为A相，甲酸水溶液为B相，梯度洗脱，程序 为：0～10min，10%～10%A；10～45min，10%～15%A；45～85min，15%～30%A ；85～104min，30%～90%A ；104～105min，90%～10%A。 流 速 1.0mL/min，进 样 量10μL，检测波长203nm，柱温25℃。

2.2 样本制备 以桔梗皂苷D为参照物，备方法为，精密称取桔梗皂苷对照品适量，置5mL量瓶中，加乙醇定容至刻度，即得每毫升含桔梗皂苷D1mg/mL的储备溶液。精密吸取上述储备溶液0.5mL，置10mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，即得浓度为50μg/mL的桔梗皂苷D参照物溶液。

供试品的制备方法为，精密称取桔梗药材5g，加10倍量水煎煮两次，每次1h，合并所得溶液，滤过，滤液浓缩至相对密度约为1.2的稠膏，冷冻干燥，冻干粉装入西林瓶中密封，即得桔梗标准汤剂。精密称取上述标准汤剂约0.2g，加20%乙醇超声30min，以0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

2.3 特征图谱建立 取“2.2”项下制备的供试品溶液，共制备10批，照“2.1”项下方法进HPLC分析，记录各共有峰的保留时间及峰面积，以桔梗皂苷D（峰3）为参照峰S，计算相对保留时间，相对峰面积和相似度。结果显示，桔梗标准汤剂共8个特征峰，相对保留时间的RSD为0.43%～0.86%，相对峰面积的RSD为6.54%～27.07%，10批标准汤剂特征图谱的相似度均在0.9以上，表明所制备标准汤剂较为稳定。根据上述结果，相对保留时间偏差较小，相对峰面积偏差较大，故仅采用相对保留时间作为方法学考察的指标。

图1 桔梗标准汤剂代表性特征图谱（A）和桔梗皂苷D对照品色谱图（B），其中3（S）为桔梗皂苷D

2.4 指纹图谱方法学考察

2.4.1 精密度考察 取同一批标准汤剂，照“2.2”项下方法制备供试品溶液，照“2.1”项下方法进HPLC分析，重复测定6次，记录特征图谱，计算各特征峰相对保留时间，计算RSD。结果显示，各特征峰保留时间RSD在0.05%～0.88%之间，表明方法精密度良好。

2.4.2 重复性考察 取同一批标准汤剂，照“2.2”项下方法制备供试品溶液，共平行制备6份，照“2.1”项下方法进HPLC分析，记录特征图谱，计算各特征峰的相对保留时间，计算RSD。结果显示，各特征峰保留时间RSD在0.08%～0.81%之间，表明方法重复性良好。

2.4.3 稳定性考察 取同一批标准汤剂，“2.2”项下方法制备供试品溶液，照“2.1”项下方法，于0、1、2、4、8、12、24h进HPLC分析，记录特征图谱，计算各特征峰的相对保留时间，计算RSD。结果显示，各特征峰保留时间RSD在0.09%～0.82%之间，表明所制备供试品在24h内稳定。

2.5 含量测定方法学考察

2.5.1 标准曲线和线性 取桔梗皂苷D参照物溶液适量，分别置不同10mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，即得桔梗皂苷D含量分别为5、10、50、100、200、500μg/mL的溶液。照“2.1”项下方法进HPLC分析，记录桔梗皂苷D峰面积，以浓度为横坐标x，峰面积为纵坐标y，进行线性回归，得回归方程为y=2430.5x-12452（r=0.9991），表明方法线性良好。

2.5.2 精密度和加样回收率考察 精密度的考察方法为，取同一批标准汤剂，照“2.2”项下方法制备供试品溶液，照“2.1”项下方法进HPLC分析，重复测定6次，记录桔梗皂苷D峰面积，计算RSD。结果显示，桔梗皂苷D的RSD为1.75%，表明方法精密度良好。

加样回收率的考察方法为，取同一批标准汤剂，分为高、中、低三个浓度，分别精密加入桔梗皂苷D对照品溶液适量（具体情况见表1），照“2.2”项下方法制备供试品溶液（除称取标准汤剂量改为0.1g），照“2.1”项下方法进HPLC分析，每个浓度样品测定3次，记录桔梗皂苷D峰面积，计算含量、回收率和RSD，结果显示，平均回收率为101.1%，RSD为2.56%，表明方法准确度良好。

2.5.3 重复性考察 取同一批标准汤剂，照“2.2”项下方法制备供试品溶液，共平行制备6份，照“2.1”项下方法进HPLC分析，记录桔梗皂苷D峰面积，计算RSD。结果显示，RSD为2.71%，表明方法重复性良好。

2.5.4 稳定性考察 取同一批标准汤剂， “2.2”项下方法制备供试品溶液，照“2.1”项下方法，于0、1、2、4、8、12、24h进HPLC分析，记录特征图谱，计算桔梗皂苷D峰面积，计算RSD。结果显示，RSD为2.37%，表明所制备供试品在24h内稳定。

2.6 含量测定与转移率 取桔梗标准汤剂，照《中国药典》2015年版一部桔梗“含量测定”项下方法进行样品处理及HPLC分析［9］，记录峰面积，计算桔梗皂苷D的含量，结果显示（表2）桔梗标准汤剂中，桔梗皂苷D的平均含量为3.32mg/g，RSD为27.01%，转移率在12.24%～42.57%之间，表明本研究所用制备方法能够较为高效地将桔梗中的主要活性成分提取出来。

表1 10批桔梗标准汤剂与药材量对应表

表2 10批桔梗标准汤剂含量测定及转移率计算结果

3 讨论

3.1 桔梗标准汤剂特征峰归属 根据文献报道，桔梗中含有多种类型的化学成分。然而，笔者在实际实验中发现，除桔梗皂苷D外，并未发现其余已有文献报道的成分在特征图谱中得到指认，其原因可能与桔梗标准汤剂的制备方法有关：由于标准汤剂严格使用制备传统中药汤剂所用溶剂（水），所得提取液中，由于溶剂极性的显著差异，导致所含化学成分的显著差异。因此，在制备标准汤剂的过程中，易溶于水的成分较其它成分更易提取。为进一步明确桔梗标准汤剂的化学成分信息，应在后续研究中进一步对各特征峰进行分离、纯化和鉴定，以期发现更多与功效主治相关的活性成分。

3.2 桔梗标准汤剂提取效率分析 以桔梗皂苷D 的含量作为指标，由表2可知，桔梗标准汤剂的提取效率在可接受范围内，提示本研究所用提取方法能够将桔梗皂苷D从桔梗药材中有效提取出来。然而，桔梗皂苷D仅为桔梗众多成分的其中一个，除此之外尚未有其它特征峰得到鉴别。为更准确评价桔梗标准汤剂的质量，应考虑继续对上述峰进行指认。

4 讨论

本研究对桔梗标准汤剂进行了含量测定和特征图谱研究，本方法准确、全面、可靠，能够对桔梗标准汤剂进行质量评价，为后续桔梗标准汤剂的质量标准提高奠定技术基础。研究结果表明，将桔梗药材经提取和冷冻干燥制成标准汤剂冻干粉后，转移率（以桔梗皂苷D含量计）较为适宜，临床应用无需加大剂量，同时可发挥标准汤剂便于携带、调配和使用的特点，是现行中药方剂使用的重要补充。

参考文献

［1］郭丽, 张村, 李丽, 等. 中药桔梗的研究进展[J]. 中国中药杂志,2007, 32(3):181-186.

［2］李婷, 徐文珊, 李西文, 等. 中药桔梗的现代药理研究进展[J]. 中药药理与临床, 2013, 29(2):205-208.

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［5］洪玮, 罗娟敏, 郭磊, 等. HPLC 法测定桔梗药材中桔梗皂苷D的含量[J]. 江西中医药, 2014, 45(374):59-61.

［6］曾金祥, 方香香, 朱继孝, 等. 不同产地桔梗皂苷成分HPLC指纹图谱比较研究[J]. 世界科学技术—中医药现代化★中药研究,2015, 17(5):1 000-1 006.

［7］李喜凤，杜云锋，谢新年. 不同产地桔梗药材HPLC 指纹图谱及桔梗皂苷D 含量测定研究[J]. 中成药, 2010, 32(4): 529-532.

［8］李喜凤，郝哲，刘素梅. 不同采收期桔梗HPLC 指纹图谱比较研究[J]. 中成药, 2010, 32(3): 353-356.

［9］国家药典委员会. 中华人民共和国药典[S].一部. 北京: 中国医药科技出版社, 2015:115.