miR-208作为急性心肌梗死的标志物研究

杨宁 蔡素丽 杨淑霞 姚慧 刘宏生

急性心肌梗死（AMI）是常见的心血管急性病。2002年到2014年我国急性心肌梗死死亡率总体上升，从2005年开始呈快速上升趋势，带来巨大的人员伤亡[1]。传统的AMI诊断标志物为心肌肌钙蛋白（cardiac troponins，cTns），目前广泛应用于临床中，可以缩短诊断急性心肌梗死（AMI）的时间[2]。但cTns敏感性不高，cTns在肺栓塞、肾衰竭中都被发现浓度上升[3-4]，所以发现新的AMI分子标记物是防治AMI的重要环节。miRNA是长度为18-25个核苷酸的小RNA分子，被证实在发育、肿瘤和心血管疾病等发挥关键作用[5]。miR-208是一种心肌组织特异表达的miRNA，可从死亡的心肌细胞中逃逸到血液，有相关报道miR-208可作为AMI的诊断指标，然而各研究存在分歧[6]。本研究针对本院53例AMI患者进行血浆miR-208浓度变化追踪并进行统计分析，报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

经济宁医学院附属医院临床伦理委员会批准，对从2015年4—12月在本科被诊断为AMI，并留院观察的患者53例（AMI组）及健康对照38例（对照组）的血浆miR-208水平进行定量分析。诊断为AMI基于以下标准的组合：缺血症状和cTnI或CK-MB水平上升；胸部疼痛持续30分钟，心电图显示病理性Q波或ST-波段上升或下降。健康对照入选标准为没有任何心电图、心肌酶指标、胸部CT异常，没有肝肾病，检测期间没有服用任何药物。所有患者及健康对照均签署书面同意。患者的年龄为（62.8±10.6）岁，健康对照为（62.3±9.2）岁。AMI组中男性占比为68.2%，对照组男性占比也调整为68.2%。本研究纳入对象的年龄、性别因素，两组人群比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

1.2 实验方法

AMI患者症状出现2小时内，对患者采血，1 000 rpm离心4分钟；用试剂盒提取总RNA；测量A260/280评价总RNA质量。用 TaqMan®microRNA RT-PCR 试剂盒 （Applied Biosystems）进行反转录，按照试剂盒说明操作。引物和探针购自Applied Biosystems。使用线虫microRNA cel-miR-39做内参，PCR条件：95℃，10分钟；95℃ 15秒，60℃ 60秒 40个循环。血浆miR-208的表达量以Cq数显示，根据文献[7]，采用相对Cq法（ΔCq）用于分析miR-208表达水平。

1.3 统计学处理

所有数据均采用SPSS19.0统计软件进行处理，计量资料以（±s）表示。两组数据比较采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

AMI组血浆miR-208的中位值为1.24；对照组血浆miR-208的中位值为0.14。统计学分析AMI组血浆miR-208高于对照组（P=0.013）。

采用受试者工作特征曲线分析（Receiver operating characteristic curve，简称ROC分析）确定miR-208对于AMI的诊断价值（图 1），miR-208的曲线下面积（Area under curve，简称AUC）为0.780。在最佳的截断值处，敏感性为88%，特异性为68%。

图1 miR-208表达特异性和敏感性曲线

3 讨论

AMI是冠状动脉急性闭塞血流中断所引起的局部心肌的缺血性坏死。在AMI早期，破损的心肌细胞已经开始向血液释放细胞内容物，包括cTnT等蛋白和miRNA等小RNA分子。这些生物分子具备可成为AMI早期诊断靶分子的潜能。

传统的疾病包括AMI的诊断靶分子多为蛋白质，但蛋白质的半寿期短、构象稳定性低、针对疾病特异性不高，这些局限让临床和基础医学专家致力寻求新的一类诊断分子[8]。miRNA是近年来被发现的一种在细胞内起着调控关键生理活动的小分子，起着类似调节蛋白的作用，且某些miRNA具有组织特异性。和蛋白相比，miRNA半寿期长、构象简单稳定，特别是高灵敏性的RNA定量分析方法的成熟，让miRNA成为一种理想的诊断分子候选者。因此，目前在多种疾病领域包括AMI，筛选miRNA作为诊断分子是国内外研究的热点。

miR-208参与心肌细胞重要的信号通路，在啮齿类动物模型心脏中过表达miR-208，可以导致心肌肥大；用Anti-miR-208降低miRNA-208表达水平则可以改善心肌功能[9-10]。多个课题组[11-12]（包括本课题组）的研究表明血浆miR-208水平的上升和心血管疾病相关。在之前的研究我们发现，在冠心病患者中miR-208的水平（中位值：1.57）显著高于对照组（0.12）。表明miR-208作为早期诊断心血管疾病的具有潜在的应用价值。作为心肌特异表达的miRNA，被发现在AMI患者的血浆中miR-208水平急剧上升，并随着介入治疗后迅速下降[13-14]，表明miR-208水平在AMI患者中血液中随症状发作而变动剧烈，可用于AMI的实时监测。miR-208是否可作为AMI早期诊断的指标，虽然有多个研究做了人群研究，表明miR-208具有成为AMI早期诊断的潜力，但数据仍存在一定的不一致性，miR-208在有的研究中敏感性为90%，特异性为96%，是非常理想的分子诊断标志物[15]；在有的研究则不令人满意，敏感性为65%，特异性为80%。在我们的研究中，miR-208在AMI的检测中，敏感性为88%，特异性为68%。数据的不一致，可能是检测方法以及取样时间的不同导致。

综上，miR-208是一种很有应用前途的AMI诊断分子，这点已被多个研究证明。但是，miR-208能尽快走向临床，需要更进一步的实验。特别是各实验室对血浆中miRNA的提取、反转录和PCR方法以及内参选择的统一，才能得到一个具有指导意义的实验数据。

表1 AMI组和对照组一般资料对比