中草药大丁草水和醇提取物的镇痛作用※

高长久张朝立* 李 洁 李文超 吴兆华

（1 牡丹江医学院药学院，黑龙江 牡丹江 157011；2 牡丹江医学院附属红旗医院血液科，黑龙江 牡丹江 157011）

大丁草（Herb of Common Leibnitzia），又名烧金草、豹子药、苦马菜、米汤菜、鸡毛蒿、白小米菜、踏地香、龙根草、翻白叶、小火草、臁草等，始载于《本草纲目》，为菊科大丁草属多年生草本植物大丁草Leibnitzia anandria（L.）Nakai［Gerbera anandria（L.） Sch Bip.］的全草，其味苦，性寒，具有清热解毒、消肿止痛等功效，主治湿热泻痢、热淋、风湿关节痛、痈疖肿毒、臁疮、虫蛇咬伤、烧烫伤、外伤出血等病证［1］。本项目分别采用水和乙醇（75%）2种溶剂对大丁草药材进行提取，通过冰醋酸扭体法、热板致痛法对其水提物与醇取物的镇痛作用进行评价，通过统计学方法分析确定大丁草的镇痛作用的有效部位，为其临床合理用药提供理论依据，为拓展其临床应用范围奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康昆明种（SPF）级小鼠，体质量为（18±22）g，雌雄兼用。由牡丹江医学院实验动物中心提供。实验前在本实验室适应性饲养3 d，室温19～25℃，相对湿度45%～68%。

1.2 实验药品与试剂 大丁草采自黑龙江牡丹峰国家级自然保护区，经黑龙江中医药大学药学院中药资源与开发教研室王振月教授鉴定为菊科植物大丁草Leibnitzia anandria（L.） Nakai［Tussi-lago anandriaL.；Gerbera anandria（L.）Sch.-Bip］；吲哚美辛肠溶片，批号171025，山西云鹏制药有限公司提供；盐酸吗啡注射液，批号160611，东北制药集团沈阳第一制药有限公司提供；冰醋酸，批号20170910，南京化学试剂股份有限公司提供；75%乙醇，批号20170925，上海时代生物科技有限公司提供。

1.3 实验仪器 分析天平，型号AUX220，岛津企业管理（中国）有限公司提供；电子天平，型号YP-6002，上海精密仪器仪表有限公司提供；旋转蒸发仪，型号RE-2010，上海濮安生物科技有限公司；离心机，型号TDL-5A，江苏省金坛市宏华仪器厂提供；电热套（加热套），型号EM2000/CE，北京诺植科技有限公司提供；循环水真空泵，型号SHB-111A，西安莫吉娜仪器制造有限公司提供；智能热板仪，型号WA.115-6B，北京卓川电子科技有限公司提供；恒温器，型号FYL-YS，上海将来实验设备有限公司。

1.4 实验方法

1.4.1 大丁草2种提取物的制备

1.4.1.1 大丁草水提物的制备 将大丁草药材剪成5～8 mm放入烧杯中，加入纯净水浸泡60 min后，先大火煮沸，小火持续沸腾25 min后，用纱布过滤后得滤液，其滤渣再加5倍水量煎煮2次后弃去，将3次煎煮所得滤液混合，放入离心机中离心，所得上清液浓缩，即为水提物，调节pH值（7.2），灭菌后放入冰箱（3～5℃）保存备用。经检测主要成分为香豆素类和黄酮类等，其中大丁苷、大丁纤维二糖苷、大丁龙胆二糖苷的含量分别为0.235%、0.089%和0.0112%。

1.4.1.2 大丁草醇提物的制备 将大丁草药材粉碎过筛，其粉末加乙醇（75%）浸泡60 min后，设置加热套70℃下回流提取3次，静置，用真空泵抽滤，合并3次滤液，置于旋转蒸发仪旋蒸回收乙醇后，即为醇提物，调节pH值（7.2），灭菌后3～5℃保存备用。经检测主要成分为香豆素类和黄酮类等，其中大丁苷、大丁纤维二糖苷、大丁龙胆二糖苷的含量分别为0.226%、0.074%和0.0093%。

1.4.2 剂量设计 大丁草给药剂量参考《中华本草》成人每日用量，按动物与人体的每千克体质量等效剂量折算系数换算成小鼠的剂量，水和醇2种提取物的给药剂量按提取量相当于生药量的比例进行换算。通过预实验，确定大丁草水和醇2种提取物镇痛实验的最低有效剂量均为3.2 g/kg，并设定大丁草水和醇2种提取物高剂量组给药剂量均为6.4 g/kg。

1.4.3 小鼠扭体实验 取72只雌雄各半小鼠，随机分成6组：大丁草水提物高、低剂量组，大丁草醇提物高、低剂量组，生理盐水组（20 mL/kg），吲哚美辛组（9.4 mg/kg），每组12只小鼠。大丁草水提物和醇提物高、低剂量组的给药剂量分别为6.4 g/kg，3.2 g/kg（生药/体质量）。每天按照0.2 mL/10 g，灌胃给药，1次/d，连续7 d。于末次给药1 h后腹腔注射0.8%冰醋酸溶液0.1 mL/10 g，放入恒温器中（设定温度为24℃），记录注射冰醋酸后15 min内各小鼠扭体潜伏期（注射醋酸后至发生首次扭体的时间）和小鼠扭体次数（腹部内凹，伸展后肢，臀部抬高为一次扭体）［2-6］。

1.4.4 小鼠热痛实验 取雌性小鼠，放入（55.0±0.5）℃智能热板仪中，以小鼠放入热板至舔后足所需时间作为痛阈值，5 min后重复测1次，筛选痛阈值为5～30 s雌性小鼠72只。将每只小鼠正常痛阈值各测2次，取其平均值为给药前正常痛阈值。除阳性对照药为盐酸吗啡注射液（20 mg/kg）外，分组及给药方法同“1.4.3”项，分别在末次药后30，60，90，120 min测定小鼠痛阈。小鼠在热板测痛仪内60 s仍无痛觉反应则取出，按60 s计［7-10］。

1.5 统计学分析 各组实验数据结果以（x±s）表示，采用SPSS 20.0软件对数据进行方差分析，组间比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 对小鼠一般特征的影响 各实验组小鼠生活状态与实验前均无明显差别，无精神萎靡或死亡，饮食量与饮水量基本稳定，各组体质量增长速度无明显差异。

2.2 对冰醋酸致小鼠疼痛的影响 与生理盐水组比较，大丁草水和醇提物高、低剂量组（生药6.4、3.2 g/kg）及吲哚美辛组（9.4×10-3g/kg）均能延长冰醋酸所致小鼠疼痛潜伏期，其中吲哚美辛组差异有极显著意义（P＜0.01），水和醇高、低剂量组差异有显著意义（P＜0.05）。大丁草高、低剂量组及吲哚美辛组均能减少小鼠扭体次数，其中高剂量组、吲哚美辛组差异有极显著意义（P＜0.01），水提物低剂量组差异有显著意义（P＜0.05），醇提物低剂量组差异无显著意义（P＞0.05）；水提物低剂量组与同剂量醇提物组比较，差异有显著意义（P＜0.05）。大丁草水和醇提物对冰醋酸致小鼠疼痛有抑制作用，水提物作用略强于醇提物。见表1。

表1 大丁草2种提取物对冰醋酸致小鼠疼痛的影响（x±s）

2.3 对热板仪致小鼠疼痛的影响 与生理盐水组比较，给药前各组痛阈值差异无统计学意义（P＞0.05）。给药后大丁草水和醇提物高、低剂量组（生药6.4、3.2 g/kg）及吗啡溶液组（20×10-3g/kg）30，60，90，120 min痛阈值均明显提高，各组差异均有极显著意义（P＜0.01）。大丁草水提物高、低剂量组与相同剂量的醇提物比较，痛阈值明显提高（P＜0.01或P＜0.05）。提示大丁草水和醇提物可提高热板致小鼠疼痛的痛阈，大丁草水提物的作用优于醇提取物。见表2。

表2 大丁草2种提取物对热板仪致小鼠疼痛的影响 （x±s）

3 讨论

中草药大丁草原植物在我国南北各地均有分布，生于山坡路旁、林边、草地、沟边等阴湿处，蕴藏量巨大，为大丁草在中医药领域的研发与应用提供了深厚的资源基础。大丁草具有清热解毒、消肿止痛等功效，推测其具有镇痛方面的相关药理作用，并尚未发现相关报道，且毒性较低［11-12］，有着较好的药用开发与利用价值。故本项目采用水和75%乙醇两种溶剂分别对大丁草进行提取，所得水提物和醇提物通过冰醋酸致小鼠扭体实验、热板仪致小鼠疼痛实验对其镇痛效果进行评价。

小鼠扭体实验结果提示大丁草水和醇两种提取物高、低剂量组（生药6.4、3.2g/kg）均能抑制腹腔注射冰醋酸溶液引起急性腹膜炎所产生大面积、持久性的化学疼痛刺激作用；小鼠热板实验提示大丁草2种提取物高、低剂量组均能抑制热板所致物理热疼痛刺激经传入神经传给中枢而达到镇痛目的。

本项目从药效学角度研究表明，大丁草水和醇两种提物高、低剂量组（生药6.4、3.2g/kg）在镇痛作用方面有统计学意义（P＜0.01或P＜0.05），且存在着一定的量效关系，为大丁草民间治疗湿热泻痢、热淋、风湿关节痛、痈疖肿痛等病证提供了药效学理论基础。同剂量水提物的镇痛效果优于醇提物，推测其与发挥镇痛作用的有效成分水溶性较好有关，这与民间应用大丁草水煎液治疗病证的方法一致。同时，本课题组对大丁草中发挥镇痛作用具体有效成分及其作用机制正在进一步研究中。