卡纳抗性结核杆菌RecA intein蛋白剪接抑制剂筛选系统

胡静平， 姜羽婷, 齐兴梅

(苏州大学 生物医学研究院， 苏州 215123)

全球有55.8万人患有耐利福平结核病(RR-TB)，而这些人中有82%为多重耐药结核病(MDR-TB)。由于治疗选择有限、药物耐受性差(与频繁的不良事件相关)以及治疗失败率和死亡率高[1]，治疗广泛性肺结核具有极大的挑战性。而在众多的抗菌药中，可用于治疗结核病的仅有几种，因此寻找新的抗结核药物迫在眉睫。

蛋白质内含子(intein)是存在于前体蛋白质中的一段插入序列，其两侧的氨基酸序列称为蛋白质外显子(extein)。在蛋白质翻译后加工成熟过程中，蛋白质内含子从前体蛋白质中自我剪切，并将两侧的蛋白质外显子以天然肽键连接形成成熟的有功能的蛋白，这一过程称为蛋白质内含子介导的蛋白质剪接[2]。蛋白剪接只发生于细菌、古细菌和单细胞真核细胞中，不发生于高等的真核生物，而分枝杆菌是真细菌类中唯一发生蛋白剪接的病原菌。研究发现，结核分枝杆菌中有3个基因即recA(Rv2732)、dnaB(Rv0058)和sufB(Rv1461)分别受到intein的调控，RecA、DnaB和SufB 这3个蛋白必须通过蛋白剪接才能成为有活性的蛋白，它们对结核杆菌的生长繁殖有重要作用[3-4]。根据所插入宿主基因的不同，这3个蛋白所含的蛋白质内含子分别称为Mtu RecA intein、 Mtu DnaB intein和Mtu SufB intein。由于蛋白内含子的氨基酸序列具有高度保守性，因此能够抑制其中任何一个intein的剪接也将会作用于其余两个intein。这一重大发现提示人们，针对intein的蛋白剪接抑制剂可以成为抗结核药物的新的作用靶点，并能最小化耐药突变株的发生。而且针对蛋白剪接的抑制剂属于特异性作用于分枝杆菌，故对人体应该不存在任何不良反应。

因此，建立一个简单可靠的蛋白质内含子抑制剂的筛选系统对于寻找新的抗结核药物势在必行。已经报道的蛋白内含子抑制剂的筛选系统[5-6]，如依赖于荧光蛋白的体外筛选系统[7-8]，依赖于细菌胸苷酸合酶、细菌CcdB毒素以及细菌DNA解旋酶亚单位A的体内筛选系统[9-10]。由于RecA intein的结构和功能研究得最为清楚，因此本研究以RecA intein为模型，成功构建了一个依赖卡那霉素抗性的蛋白质内含子剪接抑制剂筛选系统，该系统不包含任何原始蛋白外显子序列，直接以卡那霉素抗性作为蛋白剪接活性的指标，从而可快速直观地筛选针对intein的剪接抑制剂，为筛选新的抗结核药物提供便利。

1 材料与方法

1.1 材料

质粒pKH由Paul Xiang-Qin Liu教授(Dalhousie University，Canada)提供，载体上自带氨苄青霉素抗性(AmpR)和卡那霉素抗性(KanR)，并在KanR的N端插入一段组氨酸标签(His-tag)。GFP-RecAmini由刘扬中教授(中国科学技术大学化学系)提供。大肠杆菌DH5α感受态细胞，蛋白Marker，dNTP购于TaKaRa公司；PfuDNA聚合酶(Thermo)；质粒抽提试剂盒，胶回收试剂盒(Axygen)；必克隆试剂盒(abm)；鼠anti-His 抗体(GST)；荧光二抗anti-mouse IgG(Jackon)；顺铂(Sigma)；引物合成和质粒测序由苏州金唯智生物科技有限公司完成。核酸电泳仪，蛋白电泳槽，转膜仪(Bio-Rad)；PCR扩增仪，核酸蛋白分析仪，离心机(Eppendorf)。

1.2 方法

1.2.1RecA-miniintein和RecAintein基因的扩增

根据GenBank中RecAintein的基因序列，设计上下游引物，即RecA1 F：5′-tgcctcgcagagggcactcg-3′; RecA2 R：5′-GTTGTGCACGACAACCCCTTCG-3′。序列比对结果表明M.tb和BCG中含有完全相同的RecAintein的基因序列，因此从BCG中抽取基因组DNA为模板，扩增得到RecAintein基因，以GFP-RecAmini为模板扩增得到RecA-miniintein基因。

1.2.2 将RecA-miniintein和RecAintein基因序列插入pKH载体中

根据文献[11]报道，在pKH载体的KanR基因序列中选择3个位点插入MtuRecAintein序列，分别命名为40S，64S和200S。应用必克隆试剂盒采用无缝克隆将intein序列分别插入3个位点，具体步骤为：1)通过PCR将pKH载体线性化；2)通过嵌合引物扩增intein片段；3)根据试剂盒说明进行同源重组；4)转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑选阳性克隆，抽质粒测序。PCR引物如表1所示。

1.2.3 筛选有卡那霉素抗性的克隆

在pKH的3个位点中成功插入RecA-miniintein，克隆分别命名为pKH-40S-RecAmini，pKH-64S-RecAmini和pKH-200S-RecAmini。分别将含有正确质粒的单菌落在含有100 μg/mL氨苄青霉素的LB中培养过夜，等体积稀释后分别涂布于含有100 μg/mL氨苄青霉素，100 μg/mL氨苄青霉素和25 μg/mL卡那霉素平板以及100 μg/mL氨苄青霉素和50 μg/mL卡那霉素平板上，过夜培养后，计数平板上菌落个数。

1.2.4 Western Blot验证剪接活性

分别从单抗和双抗平板上挑取单克隆，过夜培养后加Loading buffer，100 ℃煮10 min裂解菌体，离心后上清进行SDS-PAGE，然后转膜以5%的脱脂奶粉封闭2 h，anti-His一抗 (1∶2000)4 ℃孵育过夜，PBST洗涤3次，每次10 min， 二抗(1∶5000)室温孵育2 h， 以双色红外激光成像系统(ODYSSEY)进行曝光扫描。

1.2.5 顺铂配合物(DDP)验证筛选系统的可行性

文献报道DDP可以抑制RecA intein的剪接[12]，以pKH为对照，分别将在含氨苄青霉素的LB中过夜培养的菌液以1∶1000转接到含有100 μg/mL氨苄青霉素，100 μg/mL氨苄青霉素和25 μg/mL卡那霉素的LB培养基中，加入不同浓度的DDP过夜培养，通过测定菌液OD600检测DDP对RecA intein的剪接抑制，从而验证此筛选系统的可行性。

表1 PCR引物

2 结果与讨论

2.1 筛选具有剪接活性的插入位点

将蛋白内含子序列插入到pKH质粒的卡那霉素抗性基因中破坏其卡那霉素抗性，若蛋白内含子成功剪接则含有该质粒的大肠杆菌可在含有卡纳霉素的LB平板上生长，反之则不能生长。蛋白内含子的剪接除了需要自身保守的氨基酸之外，对其下游外显子的第一个氨基酸(+1)要求非常严格，通常是保守的Cys、Ser和Thr。RecA intein 1/+1位为C/C组合，根据文献[13]报道，C/C组合突变为C/S组合通常不影响其剪接活性，因此本研究在不引入任何蛋白外显子序列的前提下选取了3个插入位点，分别为40S, 64S和200S，成功插入RecA-miniintein，克隆分别命名为pKH-40S-RecAmini, pKH-64S-RecAmin和 pKH-200S-RecAmini。RecA intein的全长是440个氨基酸，RecA-mini intein是将RecA intein全长序列中的归巢核酸内切酶去掉，只含有intein剪接必须的结构域，长度为168个氨基酸。将分别含有3个重组质粒的大肠杆菌10 μL涂布于氨苄平板以及氨苄和卡纳双抗平板后，平板计数。结果(表2)表明，只有64S位点插入RecA-miniintein具有卡纳抗性，即可以发生蛋白剪接，而40S和200S位点处都不能发生剪接。鉴于其双抗平板上的阳性克隆数相对较少，我们又尝试将RecAintein的全长序列插入到64S的位点(pKH-64S-RecA)，结果表明RecAintein全长比RecA-miniintein的剪接效率高。为了便于计数将1 μL过夜培养的菌液涂布3个平板，以双抗平板菌落数与单抗平板菌落数相比计算，25 μg和50 μg卡那霉素浓度的平板上的菌落数比分别为105/305和32/305。

为了确认双抗平板上的阳性克隆是由于蛋白内含子发生剪接恢复了pKH的卡那霉素抗性，分别从3个平板上挑取克隆采用Western Blot来验证，使用anti-His抗体。根据基因序列预测融合蛋白RecA+KanR为77 ku，RecA为47 ku，M为Marker，结果如图1所示。Western Blot结果与平板培养结果基本一致，剪接效率大约在30%，说明基于卡那霉素抗性的蛋白剪接抑制剂筛选系统的可行性。

表2 不同位点的卡那霉素抗性

图1 pKH-64S-RecA的Western Blot结果

Figure 1 Western Blot analysis of the splicing activity of pKH-64S-RecA

图2 DDP 对RecA intein的剪接抑制作用

2.2 顺铂对RecA intein的剪接抑制作用

为了进一步验证此筛选系统的可行性，将不同浓度的顺铂加入LB液体培养基中，通过检测菌液的OD600直接反映顺铂对intein剪接活性的抑制作用。结果(图2)显示，以pKH为对照首先排除顺铂对大肠杆菌本身生长的影响，DDP浓度达到20 μmol/L时对大肠杆菌的生长产生较大影响，因此DDP的浓度控制在20 μmol/L以内。结果表明随着DDP浓度的升高，含有pKH-64S-RecA质粒的大肠杆菌的生长受到严重抑制。由此表明依赖卡那霉素抗性的蛋白剪接抑制剂的体内筛选系统是可行的，可直观地通过大肠杆菌生长情况筛选蛋白剪接抑制剂，从而可以筛选抗结核药物。

3 结论

本研究将结核杆菌RecAintein插入卡那霉素抗性基因的多个位点，筛选得到一个依赖蛋白剪接的卡那霉素抗性的蛋白剪接抑制剂筛选系统，通过直观地观察大肠杆菌的卡那霉素抗性，可高通量地筛选针对蛋白质内含子的抗结核药物，为结核病的治疗开发新的药物。本研究通过抗性平板菌落生长结果并结合Western Blot 验证了RecAintein在pKH载体64S位点的剪接活性，充分证明了卡那霉素的抗性是依赖于intein的剪接。同时我们为了进一步验证此系统的可行性，将文献报道的可以作用于RecA intein剪接抑制的药物DDP试用于该筛选系统，结果表明含有pKH-64S-RecA质粒的大肠杆菌对DDP非常敏感，这也充分证明了此系统可以成功应用于针对intein的抗结核药物的筛选。