苦参碱对急性髓系白血病SCID模型鼠细胞生物学特性的影响

2020-07-09 21:31王颖阿茹娜吕鹏
世界中医药 2020年4期
关键词:外周血模组白血病

王颖 阿茹娜 吕鹏

摘要  目的:观察苦参碱对急性髓系白血病SCID小鼠模型细胞生物学特性的影响。方法:将40只数字随机法分为空白组( n =10)、模型组( n =30),其中模型组小鼠腹腔注射对数生长期HL-60细胞株制备急性髓系白血病模型,4周后将27只成模的模型组小鼠随机分为造模组、苦参碱A组及苦参碱B组,每组9只。其中苦参碱A组及B组分别用10 mL/kg及5 mL/kg灌胃,空白组及造模组大鼠接受等体积生理盐水灌胃,各组均连续干预4周。比较各组生存期、体质量、外周血血常规变化、同源性磷酸酶-张力蛋白(PTEN)水平变化、白血病细胞HL-60各周期生长情况以及Th1/Th2细胞的相关指标水平变化。结果:苦参碱可明显延长SCID小鼠生存期,减少外周血白细胞、淋巴细胞、HL-60细胞数量、IL-4、IL-10水平,上调PTEN、IFN-γ、IL-2水平、G0/G1期的细胞含量,与造模组比较差异有统计学意义( P <0.05)。结论:苦参碱对急性髓系白血病HL-60细胞株具有明显的抑制效应,疗效具有一定的剂量依赖性,其作用机制可能与增强PTEN蛋白及调整Th1/Th2细胞平衡有关。

关键词  急性髓系白血病;SCID模型鼠;HL-60细胞株;苦参碱;PTEN;Th1;Th2;失衡

Effects of Matrine on Cell Biological Characteristics of Acute Myeloid Leukemia SCID Model Mice

WANG Ying,A Runa,LYU Peng

(Department of Hematology,People′s Hospital of Inner Mongolia Autonomous region,Huhehaote 010017,China)

Abstract Objective: To observe the effects of matrine on the biological characteristics of SCID mice model with acute myeloid leukemia. Methods: A total of 40 mice were randomly divided into a blank group( n =10)and a model group( n =30).The acute myeloid leukemia model was established by intraperitoneal injection of logarithmic HL-60 cells in the model group.4 weeks later,27 mice in the model group were randomly divided into a model group,a matrine A group and a matrine B group,with 9 mice in each group.The rats in group A and B were given 10 mL/kg and 5 mL/kg respectively by gavage,and the rats in the blank group for 4 weeks and model group were given the same volume of normal saline by gavage for 4 weeks.The survival time,body weight,the changes of peripheral blood routine,the level of homologous phosphatase-tensin(PTEN),the growth of leukemic cell HL-60 and the level of related indexes of Th1/Th2 cells were compared in each group. Results: Matrine could significantly prolong the survival time of SCID mice,decrease the number of leukocytes,lymphocytes,HL-60 cells and the levels of IL-4 and IL-10 in peripheral blood,and increase the levels of PTEN,IFN-γ,IL-2 and G0/G1 cells in the model group. Conclusion: Matrine has obvious inhibitory effects on acute myeloid leukemia HL-60 cell line in a dose-dependent manner,and the curative effects are dependent on dose to some degree.Its mechanism may be related to the enhancement of PTEN protein and regulation of Th1/Th2 cell balance.

Keywords  Acute myeloid leukemia; SCID model mouse; HL-60 cell line; Matrine; PTEN; Th1; Th2; Imbalance

中圖分类号:R285.5 文献标识码:A  doi: 10.3969/j.issn.1673-7202.2020.04.013

急性髓细胞白血病(Acute Myeloid Leukemia,AML)是以造血祖细胞或干细胞过度增殖、分化异常或凋亡受抑制为主要表现的血液系统恶性肿瘤[1-2]。化疗是目前AML的主要治疗手段,但医疗费用昂贵、不良反应及耐药性限制其临床运用,故探寻新的、安全的抗癌方案具有重要的临床意义。近年来,中草药以其抗癌效果明显、安全性高等诸多优势被众多生物、医学界科研工作者所重视。苦参碱是中草药苦参的提取物,临床不乏其有效治疗肺癌、肝癌、胃癌等诸多实体肿瘤的临床报道[3-5],但其作用机制目前尚未清楚。本研究尝试通过细胞周期检测、Western Blotting、ELisa等手段,观察苦参碱对急性髓系白血病SCID小鼠模型细胞生物学特性的影响,以期为中西结合防治白血病提供有力证据,报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 40只SPF级SCID小鼠[购自北京维通利华实验动物技术有限公司,许可证号SCXK(京)2006-0009],所有动物饲养于本院动物实验中心,饲养条件:温度(22±1.5)℃,湿度(50±2)%,以12/12 h为光暗周期。

1.1.2 药物 AML细胞株HL-60(购自上海舜冉生物科技有限公司,批号S678);苦参碱(纯度≥98%,配置储存液浓度为10 mg/mL,购自美国Sigma公司,批号38293)。

1.1.3 试剂与仪器 同源性磷酸酶-张力蛋白单克隆一抗抗体(PTEN,购自美国CST公司,货号9188T);IFN-γELISA试剂盒(购自上海西唐生物科技有限公司,货号32462)、IL-2 ELISA试剂盒( 購自上海西唐生物科技有限公司,货号39283)、IL-4 ELISA试剂盒(购自上海西唐生物科技有限公司,货号23442)、IL-10ELISA试剂盒(购自上海西唐生物科技有限公司,货号49233);环磷酰胺(购自湘潭嘉叶源生物科技有限公司,批号XT382)。血细胞分析仪(购自济南格利特科技有限公司,型号GRT-6002型)。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备 40只小鼠随机法分为空白组( n =10)、模型组( n =30),其中模型组小鼠腹腔注射对数生长期HL-60细胞株制备急性髓系白血病模型,4周后将27只成模的模型组小鼠随机分为造模组、苦参碱A组及苦参碱B组,每组9只。各组小鼠在体质量、鼠龄各方面差异无统计学意义( P >0.05),具有可比性。

1.2.2 给药方法 苦参碱A组及B组每天分别用10 mL/kg及5 mL/kg灌胃,空白组及造模组大鼠接受等体积生理盐水灌胃,各组均连续干预4周。

1.2.3 检测指标与方法

1.2.3.1 各组小鼠一般情况比较 比较干预后各组小鼠生存期、体质量及外周血血常规的变化。

1.2.3.2 Western Blot检测各组小鼠脾脏组织PTEN水平 干预结束后各组随机抓取5只小鼠,利用10%水合氯醛腹腔麻醉后冰上快速取出脾脏组织,按照100 mg∶ 0.5 mL裂解液的比例加入适量1%PMSF的蛋白裂解液,匀浆后室温下静置10 min后,用BCA试剂盒测定样本总蛋白,根据结果得出上样量后进行电泳跑胶,转膜,加入PTEN及β-actin一抗,比例均按照1∶ 1 000稀释,再进行生物辣根过氧化酶HRP标记的二抗孵育,最后显影、拍摄,用Image(BIO-RAD公司)的图像处理软件进行处理,测定各样本灰度值。

1.2.3.3 IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ浓度检测 收集1.2.3.2步骤中大鼠的腹主动脉血,4 ℃ 10 000 r/min下离心5 min,抽吸上清液,使用ELISA(酶联免疫吸附试验)对小鼠外周血清IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ浓度进行检测,具体过程如下:将样本滴加如反应孔中,37 ℃孵育1 h,用PBS洗涤反应孔后每孔加入0.1 mL的酶标抗体,37 ℃孵育30 min,在用PBS洗涤,随后在各反应孔中加入0.1 mL的TMB底物溶液,37 ℃孵育30 min,再加入2 mol/L硫酸0.05 mL中止反应。随后将反应孔板置于酶标仪中读取数据,波长设置492 nm。操作过程全部按照试剂盒说明书进行检测。

1.3 统计学方法 采用SPSS 20.0统计学进行数据分析。计量数据都用均数±标准差(  ±s )表示,组间比较采用两样本 t 检验或两样本秩和检验;组内比较采用配对 t 检验或配对秩和检验。以 P <0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠一般情况比较 苦参碱组小鼠生存期明显较模型组延长,其中苦参碱A组生存时间长于苦参碱B组;接受造模的小鼠体质量明显较空白组下降,差异有统计学意义( P <0.05),用药后小鼠体质量有所回升,其中苦参碱A组优于苦参碱B组;苦参碱A组和苦参碱B组外周血白细胞、淋巴细胞以及HL-60细胞的数量较造模组明显下降( P <0.05),其中苦参碱A组下降趋势大于苦参碱B组( P <0.05)。见表1。

2.2 各组小鼠的实体瘤的病理变化 苦参碱A组和苦参碱B组PTEN水平较造模组明显升高( P <0.05),其中苦参碱A组上调幅度较苦参碱B组明显( P <0.05)。见图1及表2。

2.3 各组HL-60细胞G1期细胞百分比比较 苦参碱干预小鼠G0/G1期的细胞含量明显多于造模组( P <0.05), 且S期明显少于造模组( P <0.05),其中苦参碱A组优于苦参碱B组( P <0.05)。见表3。

2.4 各组外周血IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ浓度变化  造模组、苦参碱组小鼠外周血IFN-γ、IL-2水平较空白组降低,IL-4、IL-10水平均较空白组升高( P <0.05),其中苦参碱A组与苦参碱B组比较改善差异有统计学意义( P <0.05)。见表4。

3 讨论

AML是常见的血液疾病,给家庭及社会带来巨大打击,研究AML的治疗方案极具临床意义。AML是造血祖细胞或干细胞过度增殖、分化异常或凋亡受抑制,影响了正常造血功能,广泛浸润肝、脾、淋巴等重要脏器, 从而出现贫血、出血、反复感染等不良反应。有研究显示PTEN蛋白的缺失在AML发生发展过程占据重要意义。PTEN是磷酸酶活性的抑癌基因,广泛参与诸多细胞生长信号通路,与细胞诸多生物行为密切相关[7-8]。PTEN具有蛋白磷酸酶活性和脂质磷酸酶活性,通过抑制以酪氨酸激酶为主的磷酸化酶的活性而发挥抑制癌细胞生长的作用[9]。本研究制备急性髓系白血病SCID小鼠模型,结果显示造模组小鼠外周血白细胞、淋巴细胞数量较空白组明显升高,中性粒细胞较空白组明显下降,这提示造模成功。造模组小鼠PTEN水平较空白组明显下降,这提示SCID小鼠模型在被成功制备成急性髓系白血病时机体的PTEN水平下降,抗癌能力减弱。众所周知癌细胞的生长周期紊乱是导致其异常增殖的关键,传统抗癌药物多数是通过将癌细胞阻滞于G2/M或者S期而实现治疗目的的。本研究通过细胞周期检测发现造模组小鼠G0/G1期的细胞含量明显少于其他组,S期细胞含量明显多于其他组,这说明体内细胞周期调控紊乱,从而导致恶性肿瘤的发生,进一步证实造模成功。

苦参碱是中药苦参的主要成分,大量临床药理研究证实苦参碱具有多种类药理作用,包括保肝、抗病毒、升高白细胞、抗心血管疾病等。近年来苦参碱 的抗癌效应尤受关注。张文陆等[10]通过研究发现苦参碱可诱导人胃癌细胞SGC-7901的凋亡,从而实现抗胃癌效应;杨静波等[11]亦通过动物实验证实苦参碱可抑制肝癌细胞SMMC-7721的增殖,且具有明显的剂量依赖性。本研究对急性髓系白血病SCID小鼠模型进行检测,结果显示苦参碱可明显延长急性髓系白血病SCID小鼠的生存周期,并且提高其体质量,改善其血细胞的水平。在细胞周期检测中我们发现苦参碱干预小鼠G0/G1期的细胞含量明显多于造模組( P <0.05),且S期明显少于造模组( P <0.05),其中苦参碱A组优于苦参碱B组( P <0.05),提示苦参碱可影响肿瘤细胞的周期而抑制癌细胞增殖,实现抗癌效应,且具有一定的剂量依赖性。

急性髓系白血病患者出现明显的贫血、出血、发热、感染等症状,有资料[12-14]显示与免疫功能紊乱关系密切,Th1、Th2细胞广泛参与机体的免疫应答过程[15-16],IFN-γ、IL-2是Th1的标志性指标,IL-4及IL-10则是Th2的标志性指标,Th1与Th2处于相互调节、相互抗衡的动态平衡状态,如果其中指标出现异常,则破坏Th1与Th2的动态平衡[17-18],急性髓系白血病患者机体亦存在Th1与Th2的动态平衡受破坏,故恢复Th1与Th2的动态平衡是治疗该病的关键。研究中发现造模组、苦参碱组小鼠外周血IFN-γ、IL-2水平较空白组降低,IL-4、IL-10水平均较空白组升高,其中苦参碱A组较苦参碱B组改善,提示调整Th1与Th2的动态平衡可能是苦参碱有效治疗急性髓系白血病的作用机制之一。

参考文献

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(2019-05-15收稿 责任编辑:芮莉莉)

基金项目:国家自然科学基金项目(81460027);内蒙古自治区自然科学资助基金项目(2018MS08070)作者简介:王颖(1980.08—),女,硕士研究生,主治医师,研究方向:急性白血病的治疗,E-mail:cfwy1980@163.com

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