过敏性哮喘患儿外周血ORMDL3 mRNA与T细胞亚群Th1/Th2失衡的关系

麦朗君，饶雪梅，曾学文，张龙奕，林烈桔

过敏性哮喘是一种常见慢性炎性疾病，主要病理学特征是呼吸道炎性反应和气道重塑，临床表现为咳嗽、喘鸣及呼吸困难，80%以上过敏性哮喘发病起始于儿童时期，因此早期诊断和治疗对于降低过敏性哮喘发病率十分重要[1-2]。血清类黏蛋白1样蛋白3(ORMDL3)基因是ORMDL基因家族成员之一，是一种能引起儿童哮喘的易感基因[3-4]，其作用机制是激活T淋巴细胞、负性调节神经鞘脂类产生、增加未折叠蛋白反应。该基因在人体多处组织中普遍表达，其中肝脏和外周血淋巴细胞中表达最高[5]。辅助性T细胞(Th)与哮喘炎性反应和免疫应答有密切联系，且在儿童哮喘中发挥重要作用[6]。许多研究表明，辅助性T细胞亚群1/辅助性T细胞亚群2(Th1/Th2)状态失衡与哮喘发病密切相关，Th2参与的嗜酸粒细胞(EOS)浸润在哮喘发生的过程中有重要作用[7-8]。ORMDL、Th1/Th2与哮喘发病都有一定联系，但目前关于两者在过敏性哮喘患儿外周血中表达水平相关性的研究较少。因此，本研究通过检测过敏性哮喘患儿外周血中ORMDL3、Th1/Th2水平，探讨过敏性哮喘患儿外周血ORMDL3与T细胞亚群Th1/Th2失衡的关系，为过敏性哮喘的预防和评估提供重要依据，报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2018年3月—2019年10月海南省儋州市人民医院儿科治疗过敏性哮喘患儿83例(哮喘组)为研究对象，其中男44例，女39例；年龄3～13(7.38±4.59)岁；就诊时合并症，鼻炎16例，荨麻疹5例；病情程度，无症状8例，轻症12例，中症36例，重症27例；既往过敏史：鼻炎16例，荨麻疹5例，药物过敏2例；家族遗传史18例。选取同期于医院健康体检儿童76例作为对照组，其中男32例，女44例；年龄3～12(6.79±4.96)岁。2组性别、年龄比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究经医院伦理委员会批准，符合伦理学要求，受试对象或其家长知情同意并签署知情同意书。

1.2 选择标准 (1)纳入标准：①符合过敏性哮喘诊断标准[9]；②年龄3～13岁；③入组前1周未使用抗白三烯、抗组胺类药物；④入组前4周无全身糖皮质激素应用。(2)排除标准：①患其他呼吸系统疾病；②有糖皮质激素和β2受体激动剂过敏史；③有其他心肺疾病及精神异常；④入组前4周患呼吸道感染。

1.3 观测指标与方法

1.3.1 样品采集及保存：于就诊或健康体检当天清晨抽取2组儿童空腹外周静脉血6 ml，其中4 ml 用于ORMDL3、Th1/Th2指标检测；2 ml离心收集血清，置于-80℃保存，用于IgE检测。

1.3.2 外周血ORMDL3 mRNA水平检测： 以RNA提取试剂盒(北京天根生化有限公司)提取外周血总RNA，逆转录试剂盒(宝生物工程大连有限公司)反转录获得cDNA;采用qRT-PCR仪(美国Bio-Rad公司，型号Bio-Rad iQ5)和miScript SYBR Green qPCR Kit试剂盒(德国QIAGEN公司)对ORMDL3进行扩增;qRT-PCR反应体系共10 μl：miScript SYBR Green Mix 5 μl，cDNA(50 ng/μl)1 μl，上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μl，ddH2O 3.0 μl。反应条件：95℃、90 s，95℃、30 s，63℃、30 s，40个循环；72℃、10 min。ORMDL3及内参GAPDH引物由上海生工生物公司合成，序列见表1。采用2-△△CT法对外周血ORMDL3 mRNA表达水平进行定量分析。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3.3 外周血Th1/Th2水平检测： RPMI 1640(不含小牛血清FBS)培养基等体积稀释外周血100 μl，加入刺激剂10 μl，37℃、5% CO2培养箱培养4～6 h。混匀，加入CD8-PC7和CD3-PC5各10 μl，室温下避光孵育15 min；加入 100 μl Fix&Perm破膜剂(美国Beckman公司)中的Reagent 1(即固定液)，室温避光孵育15 min；加入PBS 3 ml，离心5 min，弃上清。每管中加入 100 μl Fix&Perm中的Reagent 2(即破膜和溶血液)，各管加入IFN-γ-FITC单克隆抗体和IL-4-PE单克隆抗体(美国Beckman公司生产)10 μl，室温下避光孵育15 min。每管中加入PBS 3 ml， 离心弃除上清； PBS 0.5 ml重悬细胞，流式细胞仪(美国BD公司，型号FACSCalibur)检测。每个样本每次检测1×104个细胞。

1.3.4 肺功能指标、EOS、血清IgE水平检测：利用肺功能仪(日本美能公司，型号AS-507)检测患儿安静睡眠时达峰时间比(TPTEF/TE)、达峰容积比(VPEF/VE)；一氧化氮测定仪(广州瑞普医疗科技有限公司，型号6900)检测呼出气一氧化氮(FeNO)；血细胞分析仪(济南童鑫生物科技公司，型号HB7501)进行分类计数并计算EOS百分比；ELISA试剂盒(上海冠导生物工程有限公司)测定血清IgE水平。

2 结 果

2.1 2组外周血中ORMDL3 mRNA、Th1、Th2表达水平比较 哮喘组外周血中ORMDL3 mRNA、Th2表达水平均显著高于对照组(P<0.01)，Th1、Th1/Th2水平显著低于对照组(P<0.01)，见表2。

2.2 2组肺功能指标、EOS、血清IgE水平比较 哮喘组FeNO、EOS、血清IgE水平均显著高于对照组(P<0.05)，TPTEF/TE、VPEF/VE显著低于对照组(P<0.05)，见表3。

表2 2组外周血中ORMDL3、Th1、Th2表达水平比较

2.3 外周血ORMDL3 mRNA与Th1/Th2水平相关性分析 Pearson分析结果显示，过敏性哮喘患儿外周血中ORMDL3与Th1/Th2水平呈负相关(r=-0.587，P<0.05)，见图1。

图1 过敏性哮喘患儿外周血中ORMDL3 mRNA 与Th1/Th2水平相关性

2.4 ORMDL3 mRNA、Th1/Th2与肺功能指标、EOS、血清IgE水平相关性分析 Pearson法分析结果显示，过敏性哮喘患儿ORMDL3与TPTEF/TE、VPEF/VE呈负相关(P<0.01)，与FeNO、EOS、血清IgE水平呈正相关(P<0.01)。Th1/Th2与TPTEF/TE、VPEF/VE呈正相关(P<0.01)，与FeNO、EOS、血清IgE水平呈负相关(P<0.01)，见表4。

表3 2组肺功能指标、EOS、血清IgE水平比较

表4 过敏性哮喘患儿ORMDL3、Th1/Th2与肺功能指标、 EOS、血清IgE水平相关性分析

2.5 影响过敏性哮喘的多因素Logistic回归分析 将是否发生过敏性哮喘作为因变量，以ORMDL3、Th1/Th2、TPTEF/TE、VPEF/VE、FeNO、EOS、血清IgE为自变量进行Logistic回归分析，结果显示ORMDL3、血清IgE是影响过敏性哮喘发生的危险因素，Th1/Th2是影响过敏性哮喘发生的保护因素，见表5。

表5 影响过敏性哮喘发生的多因素分析

3 讨 论

过敏性哮喘多发于儿童时期，是哮喘发病初期，其发病特征主要为反复喘息、胸闷、咳嗽、气促[10-12]。过敏性哮喘发病的外部原因主要有接触变应原、物理化学诱因、冷空气等，而内部原因主要是机体免疫耐受功能受损，致使免疫细胞对自身组织结构破坏，而T淋巴细胞在此过程中发挥十分重要的作用[13-15]。

ORMDL3是首个被鉴定出的哮喘易感基因，序列高度保守，编码一种跨膜蛋白[16]。 许多过敏原能导致ORMDL3基因表达上调，最终导致哮喘发生[17]。且有研究表明，某些哮喘治疗药物可通过下调ORMDL3基因表达达到治疗哮喘的目的[18]。Kothari等[19]研究17q21号染色体上与哮喘高度相关的一个基因发现，ORMDL3表达上调导致气道平滑肌增殖和收缩能力增强，从而提高哮喘患者的气道高反应性，使哮喘加重。本研究中哮喘组外周血中ORMDL3表达水平显著高于对照组，提示过敏性哮喘患儿外周血中ORMDL3表达水平高于健康儿童，ORMDL3可能通过在过敏性哮喘患儿外周血中高表达来作用某些哮喘相关基因位点，进一步参与过敏性哮喘发生发展，本研究与Kothari等[19]研究结果基本一致。

Th在气道慢性变应性炎性反应中发挥重要作用，而Th1和Th2分泌细胞因子，彼此相互抑制，Th1/Th2状态失衡在哮喘发病过程中发挥关键作用[20]。Th2分泌的细胞因子可促进血清IgE合成、诱导EOS前体分化、激活和趋化EOS。Hwang等[21]研究表明，污染物邻苯二甲酸二异壬酯在体外抑制Th1极化，增强Nave CD4+T细胞Th2的极化，且邻苯二甲酸二异壬酯通过产生IL-4、IL-5、血清IgE、IgG1，以及减少IFN-γ、IgG2A诱导过敏性哮喘，增加哮喘患者Caspase-1和Caspase-3的表达，从而证明Th1/Th2的失衡能增加过敏性哮喘的发生几率。本研究中哮喘患儿外周血中Th1、Th2、Th1/Th2水平与健康儿童比较有显著差异。提示过敏性哮喘患儿外周血中Th1/Th2处于失衡状态，而Th1/Th2细胞因子活化平衡表现为免疫保护，此时的失衡可能引起机体免疫紊乱并诱发免疫介导的过敏性哮喘。进一步提示哮喘的发作可能与Th1亚群功能低下，Th2亚群功能亢进有关。本研究与张如幸等[22]研究结果基本一致。

许多研究表明，哮喘患者ORMDL3、Th1/Th2与EOS水平都具有一定的相关性，两者通过相互作用影响过敏性哮喘患者体内EOS水平，最终影响过敏性哮喘的严重程度[23-24]。本研究结果中哮喘患儿FeNO、EOS、血清IgE、TPTEF/TE、VPEF/VE等肺部指标水平均与健康儿童有较大差异。提示过敏性哮喘患儿呼吸道免疫炎性反应水平相对升高，气道内大量附着黏性液体，患儿小气道阻力上升，肺功能可能受损，导致TPTEF/TE、VPEF/VE等指标水平明显下降，与田军等[25]研究结果基本一致。过敏性哮喘患儿ORMDL3、Th1/Th2与TPTEF/TE、VPEF/VE、FeNO、EOS、血清IgE等指标水平均呈现一定的相关性，提示ORMDL3、Th1/Th2可能通过相互作用影响过敏性哮喘患儿机体内炎性反应水平，导致患儿气道炎性反应加重，使TPTEF/TE、VPEF/VE等指标水平明显异常，进一步影响过敏性哮喘的严重程度。Logistic回归分析结果显示，ORMDL3、血清IgE是影响过敏性哮喘发生的危险因素，Th1/Th2是影响过敏性哮喘发生的保护因素。提示ORMDL3、血清IgE、Th1/Th2水平高低影响过敏性哮喘发生，且随ORMDL3、血清IgE水平升高及Th1/Th2水平降低，过敏性哮喘发生几率升高。

综上所述，过敏性哮喘患儿外周血中ORMDL3与T细胞亚群Th1/Th2水平呈负相关，ORMDL3在外周血中的表达水平对Th1/Th2状态失衡有影响。临床上应密切关注过敏性哮喘患儿外周血中ORMDL3 mRNA、Th1/Th2的水平，及时做出诊断及预防。但ORMDL3基因的多态性与哮喘发生之间的关系仍需进一步研究。