血清miR-125b、miR-142-3p表达与脓毒症预后的关系及其预测价值

徐志育，谢晓红，朱永，周忠义，雷振林

脓毒症是一种由感染、创伤等损伤因素引发的全身炎性反应综合征(SIRS)[1]，该综合征在重症医学科(ICU)较为多见，因此ICU患者的病死率通常高于其他科室[2]。目前，关于脓毒症的发病机制尚未完全明确，大多数学者认为其发病的核心为炎性反应失衡[3]，当机体受到创伤、感染等损伤时，机体的各种细胞和体液系统被激活，产生大量的炎性介质，炎性介质又会作用于各种炎性细胞，产生级联放大效应，加重机体的炎性反应，导致全身炎性反应失衡，最终发展成全身多器官功能障碍[4]。因此，控制全身炎性反应失衡，有助于脓毒症患者的治疗和预后[5]。微小RNA(microRNA，miRNA)是一类由内源性基因编码的单链RNA，其长度为18～22个核苷酸，主要通过降解信使RNA(mRNA)或抑制翻译过程调控转录后基因表达，从而参与发育、炎性疾病、脓毒症和衰老等过程[6-7]。研究发现，miR-125b和miR-142-3p与炎性反应密切相关，可以通过多种途径调控炎性因子的表达[8-9]。因此，现检测患者血清miR-125b和miR-142-3p的表达，分析其与相关临床指标和实验室指标的关系，及其对脓毒症患者的预后评估价值，报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2017年1月—2019年10月海南省人民医院重症医学科重症监护室(ICU)住院的脓毒症患者100例作为脓毒症组，其中腹腔感染34例，肺部感染38例，颅内感染10例，泌尿系统感染18例。男43例，女57例，年龄25～83(61.43±20.52)岁，急性生理和慢性健康评分量表(APACHE Ⅱ)评分为(17.22±7.17)分，序贯器官衰竭估计评分(SOFA)为(7.25±3.51)分。另选取同期于医院ICU住院的非脓毒症患者90例作为对照组，其中脑出血35例，脑梗死42例，其他13例。男42例，女48例，年龄27～80(58.92±18.46)岁, APACHE Ⅱ评分为(15.96±5.63)分，SOFA评分为(6.52±3.75)分。2组患者性别、年龄、APACHE Ⅱ评分和SOFA评分比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究经医院伦理委员会批准，患者或家属对研究知情同意且签署同意书。

1.2 选择标准 (1)纳入标准：①符合2016年美国重症医学会和欧洲重症医学会联合发布的脓毒症Sepsis3.0诊断标准[10]；②年龄>18岁。(2)排除标准：①入院1 d内死亡者；②入院前使用激素药物；③合并恶性肿瘤的患者；④患有慢性肝脏疾病、肾脏疾病和自身免疫性疾病的患者。

1.3 观测指标与方法

1.3.1 APACHEⅡ、SOFA评分相关指标检测[11]：2组患者进入ICU后24 h内，根据APACHE Ⅱ的相关计算参数收集体温、血钾、血钠等相应指标的最差值，并计算APACHE Ⅱ评分；按照SOFA的相关计算参数收集血小板、多巴胺、胆红素等相应指标的最差值，计算SOFA评分。

1.3.2 WBC、PCT和CRP检测：患者进入ICU 24 h内采集肘静脉血10 ml，放置1 h后， 离心收集上层血清。其中5 ml血清使用全自动生化分析仪检测白细胞总数(WBC)、降钙素原(PCT)和C反应蛋白 (CRP)。另5 ml血清放置于-80℃超低温冰箱保存。

1.3.3 血清炎性因子检测：将储存在超低温冰箱的血清取出，置于室温融化，使用酶联免疫吸附试验法检测血清肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)和IL-6，试剂盒均购自Abcam公司，所有样品处理和操作严格按照试剂盒说明进行。

1.3.4 血清miR-125b和miR-142-3p表达检测： 使用血清RNA提取试剂盒(Life Technologies公司)提取血清总RNA，使用Nanodrop 2000(Thermo Fisher Scientific 公司)检测总RNA浓度和纯度，采用北京天根生化科技有限公司的RNA逆转录试剂盒将提取总RNA逆转录成cDNA。以cDNA为模板进行实时荧光定量PCR：反应体系20 μl，2 × qPCR Mix 10 μl、上下游引物各2 μl、cDNA 1 μl、ddH2O 7 μl。反应过程：预变性 95℃、15 min， 72 ℃、34 s， 94 ℃、29 s， 60 ℃、34 s，重复循环40 次；溶解曲线 72 ℃、1 min。以U6作为内参基因，采用2-△△Ct法计算miR-125b和miR-142-3p的相对表达量，以表示目的基因表达水平。引物序列见表1。

表1 不同基因的引物序列

2 结 果

2.1 2组临床资料比较 脓毒症组WBC、CRP、PCT、TNF-α、IL-6、IL-1β、miR-125b和miR-142-3p水平高于对照组(P均<0.01)，2组APACHE Ⅱ评分和SOFA评分比较差异无统计学意义(P均>0.05)，见表2。

表2 2组患者临床资料比较

2.2 脓毒症患者2亚组临床资料比较 根据脓毒症患者28 d病死情况将患者分为存活亚组(63例)和死亡亚组(37例)。存活亚组患者入院时APACHE Ⅱ评分、SOFA评分、PCT、TNF-α、IL-1β、miR-125b和miR-142-3p水平均低于死亡亚组(P均<0.01)；而2亚组WBC、CRP和IL-6水平比较差异无统计学意义(P均>0.05)，见表3。

表3 2亚组患者临床资料比较

2.3 miR-125b和miR-142-3p与脓毒症相关指标的关系 Pearson相关性分析显示，miR-125b与APACHE Ⅱ评分、SOFA评分、CRP、PCT、TNF-α和IL-6呈正相关(P均<0.05)，与WBC和IL-1β无明显相关性(P>0.05)；miR-142-3p与PCT、TNF-α、IL-6和IL-1β呈正相关(P均<0.05)，与APACHE Ⅱ评分、SOFA评分、WBC和CRP无明显相关性(P>0.05)，见表4。

表4 miR-125b和miR-142-3p与脓毒症相关指标的关系

2.4 miR-125b和miR-142-3p对脓毒症患者的预后价值 绘制ROC曲线评估miR-125b和miR-142-3p对脓毒症患者预后的预测价值，血清miR-125b的AUC为0.746(95%CI0.676～0.817)，最佳临界值为1.74，敏感度和特异度分别为79.57%和72.26%，约登指数为0.518；血清miR-142-3p的AUC为0.685(95%CI0.609～0.760)，最佳临界值为2.68，敏感度和特异度分别为68.03%和71.15%，约登指数为0.392，见图1。

图1 miR-125b和miR-142-3p对脓毒症预测价值的 ROC曲线分析

3 讨 论

脓毒症是ICU危重患者死亡的主要原因之一，据统计，全球每年脓毒症新发病例约3 150万例，每年死亡例数达到530万例[12]。有学者提出早期预测脓毒症患者死亡风险，及时给予个体化治疗具有十分重要的临床意义[13]。现有生物标志物如IL-6、CRP、WBC和PCT是评价感染的指标，但这些指标在一些非感染性疾病中也升高，对于死亡风险的预测能力有限[14]。近几年研究显示，由于miR在血液中的稳定性强，化学结构简单，因此，循环系统中miR用作生物标志物的性能可能优于其他血清标志物[15]。多项研究显示miR-125b和miR-142-3p是某些炎性疾病的风险标志物[8, 9, 16]，并且miR-125b和miR-142-3p参与了脓毒症的发病过程[17-18]，提示miR-125b和miR-142-3p可能作为脓毒症的死亡风险标志物。

本次研究中，脓毒症组患者血清WBC、CRP、PCT、TNF-α、IL-6和IL-1β水平明显高于对照组，李爱林等[19]的研究也显示，脓毒症患者血清CRP和PCT水平高于健康成年人。本研究采用多项炎性因子指标，进一步验证了脓毒症是一种全身炎性反应综合征，机体存在炎性反应失衡[20]，同时也检测了血清中miR-125b和miR-142-3p表达水平，发现脓毒症组患者血清miR-125b和miR-142-3p表达水平显著高于对照组，Zhu[21]的研究也发现，miR-125b在脓毒症组患者血清中表达水平显著增加，上述研究均提示miR-125b和miR-142-3p与脓毒症有关。有miR测序研究显示，miR-125b是炎性疾病的潜在标志物[16]，本次研究发现，死亡亚组患者入院时血清miR-125b相对表达量高于存活亚组。ROC曲线结果显示，血清miR-125b预测脓毒症患者预后的AUC为0.746，最佳临界值为1.74，敏感度和特异度分别为79.57%和72.26%,提示miR-125b也可以作为脓毒症患者死亡风险增加的生物标志物。而Zhu[21]的研究中血清miR-125b预测脓毒症患者预后的AUC为0.658，低于本次研究，可能是患者病情的严重程度不同及基础疾病不同造成的。本研究还发现，死亡亚组患者入院时APACHE Ⅱ评分、SOFA评分、PCT、TNF-α和IL-1β水平也显著高于存活亚组，说明病情和感染越严重的患者预后越差。此外，miR-125b与APACHE Ⅱ评分、SOFA评分、CRP、PCT、TNF-α和IL-6水平呈正相关，提示miR-125b可能是通过多种途径促进机体炎性反应和器官功能障碍，具体机制可能是miR-125b和p38丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)相互作用，通过调节p38 MAPK/核转录因子κB (nuclear factor kappa-B，NF-κB)信号通路促进炎性因子的释放[18]，因此miR-125b与TNF-α和IL-6呈正相关，以严重炎性反应为特征的脓毒症患者血清miR-125b的表达水平也升高。另一方面，脓毒症会诱发多种器官功能障碍和衰竭，而miR-125b可以促进心脏纤维化及成纤维细胞转变成肌成纤维细胞，还可以引起急慢性肝功能衰竭[22-23]，因此以多器官功能障碍和衰竭为特征的脓毒症患者血清miR-125b表达水平增加。

本次研究还发现，死亡亚组患者入院时血清miR-142-3p表达水平高于存活亚组，miR-142-3p表达与PCT、TNF-α、IL-6和IL-1β呈正相关，提示miR-142-3p可能参与调控炎性因子的表达，其机制可能与Sirtuin1有关，研究显示，miR-142-3p可通过Sirtuin1/NF-κB信号通路促进炎性因子的释放[24]，脓毒症动物模型研究显示，miR-142-3p可能通过降低腺苷酸环化酶(adenylyl cyclase，AC)的表达促进炎性反应，进而调控TNF-α和IL-1β的表达水平[16]，且另外有研究显示，miR-142-3p可以直接调控IL-6的表达水平[25]。但miR-142-3p与APACHE Ⅱ评分、SOFA评分、WBC、CRP无明显相关性，说明miR-142-3p与脓毒症的关联弱于miR-125b，经ROC曲线评估其预测价值，发现其AUC、敏感度及特异度均小于miR-125b，提示miR-142-3p表达虽然在脓毒症患者中异常升高，但其预测脓毒症患者预后的价值较miR-125b低，这可能是受到样本量及遗传因素的影响造成结果的偏倚。本研究因研究时间有限，尚未进一步探究miR-125b和miR-142-3p在脓毒症发生发展过程中的机制，后续将扩大样本量并做二者的联合检测以期提高对脓毒症患者预后的预测价值，为临床脓毒症的治疗提供依据。

综上所述，脓毒症患者血清中 miR-125b和miR-142-3p表达升高，且均与不良预后有关，miR-142-3p表达与PCT、TNF-α、IL-6和IL-1β呈正相关，其预测脓毒症患者的价值较低，miR-125b表达与APACHE Ⅱ评分、SOFA评分、CRP、PCT、TNF-α及IL-6均呈正相关，其对脓毒症患者预后具有较好的预测价值。