黄芪多糖通过TLR4/NF-κB通路抑制COPD大鼠炎性反应诱导的平均血小板体积降低

曹亮，刘建华，冯平，赵建清

平均血小板体积(MPV)是检测血小板活化的替代指标[1]。前炎性因子和急时相反应物产生过多可通过干扰巨核细胞功能，使骨髓释放出小体积血小板。慢性阻塞性肺疾病(COPD)是由多种炎性细胞、炎性介质及细胞因子介导的慢性炎性反应性疾病，COPD急性加重(AECOPD)是导致患者住院治疗和死亡的重要原因之一。以往研究发现[2]，AECOPD恢复期患者MPV减小，且减小程度与AECOPD病情严重程度相关。黄芪多糖(APS)是中药黄芪的主要活性成分之一，对肺组织炎性反应损伤有保护作用[3]。ASP对抑制COPD炎性反应的研究尚不多见，现分析ASP抗炎程度与MPV变化的关系，为MPV能够有效评估COPD病情严重程度提供依据，报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料 (1)实验动物：SPF级雄性SD大鼠60只，8周龄，体质量(200±20)g，购自河北省实验动物中心，许可证号：SCKK(冀)2013-1-003。大鼠自由进食饮水，适应性饲养1周，平均温度25℃，相对湿度65%～70%，光照12 h。(2)药物与试剂：乌拉坦(购自上海化学试剂厂)、青霉素(购自东北制药公司)、链霉素(购自山东鲁抗制药股份有限公司)，RPMI-1640培养基(购自上海联硕生物科技有限公司)， ELISA试剂盒(购自上海信帆生物有限公司)，人巨核细胞株Meg-01细胞(购自上海一研生物科技有限公司)。(3)仪器：台式高速离心机(购自长沙湘锐离心机有限公司，型号 TG22-WS)、全自动血液分析仪(购自厦门海菲生物技术有限公司，型号 BC-3300CT)、医用生物显微镜(购自云南远锦光学仪器有限公司，型号 XSB)、LQS酶标仪(购自北京中西远大科技有限公司，型号SP21-318C)、凝胶成像仪(购自上海嘉鹏科技有限公司，型号 ZF-288)。

1.2 实验方法 2019年12月—2020年2月于河北北方学院附属第一医院实验室进行实验。

1.2.1 COPD模型大鼠制备与分组： 60只大鼠随机数字表法分为6组，即空白对照组，模型组，黄芪多糖400、600、800 mg/kg组和泼尼松(6 mg/kg)组，每组10只。COPD大鼠造模方法参考文献[4]：于第1日、14日实施麻醉后经气管注入脂多糖(LPS，1 g/L)200 μl，第2～28日(不含第14日)置于密封的烟室中，每日吸入香烟烟雾(含焦油19 mg、尼古丁1.2 mg)1次，每次持续吸入30 min。黄芪多糖各组与泼尼松组每天注入脂多糖或吸烟前给予不同剂量黄芪多糖及泼尼松灌胃；空白对照组、模型组平行给予生理盐水灌胃。胸部X线摄片出现两侧膈肌下降、肋间隙增宽、肺野透亮度增加，表明COPD大鼠造模成功[5]。

1.2.2 骨髓巨核细胞培养与分组： 为进一步明确黄芪多糖促进骨髓巨核细胞成熟的作用是直接的，亦或是间接的，因此另取人巨核细胞株Meg-01细胞进行实验，以促血小板生成素(TPO)为阳性对照，观察黄芪多糖能否直接促进大鼠中骨髓巨核细胞的成熟。从液氮罐中取出具有晚期成熟性状的人巨核细胞株Meg-01细胞(购自美国ATCC公司)，置于37 ℃水浴中快速解冻，然后加PBS于室温下1 000 r/min离心5 min，PBS重悬洗涤细胞3次并离心除去PBS，细胞用改良RPMI-1640培养基(含10%小牛血清、青霉素和链霉素各100 U/ml)重悬，轻轻吹打至单细胞悬液，再移至培养皿中置于5%CO2、37℃细胞培养箱中常规培养。将细胞悬液转移到离心管中，1 000 r/min离心5 min，弃上清，沉淀用新鲜培养基吹打成细胞悬液后进行分皿，加培养基到合适密度传代细胞，选取对数生长期的细胞进行实验。根据实验需要，将对数期的Meg-01细胞分为6组[6]。(1)对照组：含10%胎牛血清的伊思柯夫改良培养液(IMDM)培养基。(2)黄芪多糖组：黄芪多糖100 mg/L+IMDM培养基。(3)白介素1β(IL-1β)组：IL-1β 20 μg/L+IMDM培养基。(4)白介素8(IL-8)组：IL-8 20 μg/L+IMDM培养基。(5)肿瘤坏死因子α(TNF-α)组：TNF-α 20 μg/L+IMDM培养基。(6)TPO组：TPO 50 μg/L+IMDM培养基。Meg-01细胞以1×105/ml的密度接种于24孔板，加入相应培养液，5%CO2、37℃细胞培养箱中培养24 h。

1.2.3 大鼠骨髓巨核细胞采集与形态观察： 将大鼠脱臼处死，迅速剥离双侧股骨，剪断股骨两端，在培养皿中用装有 PBS 洗液的 1ml 注射器，向骨髓腔内快速推入，反复冲洗骨髓细胞，直至股骨外观呈白色时骨髓全部冲出。用1 ml空针头将含有骨髓的液体过滤至离心管中， 2 000 r/min离心10 min，弃去上清液，取下层骨髓沉淀迅速涂片。风干后瑞氏染色 5 min，流水冲洗，室温晾干。每张骨髓片以直径6 mm范围内细胞数目为基准，光镜下观察并计算全片巨核细胞数和产板巨核细胞数。

1.2.4 大鼠MPV测量： 对每只大鼠使用尾尖采血法取血液2 ml，固定动物并析出鼠尾，将鼠尾在45℃温水中浸泡数分钟，也可用二甲苯等化学药物涂擦，使局部血管扩张。将鼠尾擦干，剪去尾尖，血自尾尖流出，让血液滴入盛器或直接用移液器吸取。将血液于抗凝管中，采用BC 3000CT全自动血液分析仪(深圳迈瑞)测量血样中MPV。

1.2.5 大鼠血清炎性因子检测：大鼠腹腔注射25%乌拉坦麻醉，腹主动脉采血8 ml，1 500 r/min离心20 min，取血清。以酶标仪检测血清IL-1β、IL-8、TNF-α水平,严格按照ELISA试剂盒说明书操作。

1.2.6 Western-blot检测肺组织中Toll样受体4(TLR4)、核因子-κB(NF-κB)蛋白表达：获取大鼠肺组织细胞，用PBS洗涤3次，用试剂盒提取蛋白后，采用BCA蛋白定量法测定蛋白浓度。SDS-PAGE电泳分离，分离的蛋白在200 mA下转膜至PVDF膜上。转膜完成后，4℃下用5%脱脂牛奶封闭膜过夜，一抗(1 ︰1 000 TLR4，1 ︰1 500 NF-κB，1 ︰1 000 β-actin)4℃孵育过夜，洗膜后换HRP标记Ⅱ抗室温孵育2 h。将漂洗后的膜放入干净的皿中，暗室中吸取等量发光试剂A液与B液并混匀，然后均匀浇注在PVDF膜蛋白面上，数秒后用凝胶成像仪分析，Image J软件分析TLR4、NF-κB 灰度值。

1.2.7 实时荧光定量PCR检测肺组织中炎性因子mRNA表达： 按照Trizol试剂说明书要求提取总RNA并通过逆转录—聚合酶链反应逆转录为cDNA，使用RT-PCR仪进行扩增，以GAPDH为内参检测肺组织中IL-1β、IL-8、TNF-α mRNA的相对水平。所有引物均由上海生工生物技术公司合成，见表1。检测结果采用2-△△Ct法进行相对表达分析。

表1 RT-PCR引物序列

1.2.8 血小板膜糖蛋白CD41(CD41)、血小板膜糖蛋白Ⅰba(GPIba)表达的测定：收集Meg-01细胞，1 000 r/min离心5 min，PBS洗涤细胞并调整细胞浓度为1.0×106/ml。取细胞悬液各20 μl，PE-anti-human CD41试剂1 ︰10稀释后加入到细胞悬液中，37℃温箱中孵育30 min，加PBS至400 μl，流式细胞仪检测CD41的表达。另取细胞悬液各50 μl，加入SE-2抗体2 μg/ml于37℃温箱中孵育30 min，山羊抗小鼠IgG(H+L)FITC试剂1 ︰200稀释后加入细胞悬液中，轻轻混匀，37 ℃温箱中孵育30 min后加PBS至400 μl，流式细胞仪检测GPIba。

2 结 果

2.1 各组大鼠表现特点比较 空白对照组大鼠精神状态良好，饮食、呼吸正常；模型组大鼠精神不振、反应迟钝，食欲降低、体质消瘦，伴有咳嗽、哮鸣音、痰鸣音等呼吸系统表现；泼尼松组大鼠精神状态、呼吸、饮食均得到改善；各黄芪多糖组随剂量升高，大鼠病情缓解更加明显，800 mg/kg时改善最为显著。

2.2 各组大鼠骨髓巨核细胞及MPV比较 与空白对照组比较，模型组大鼠骨髓巨核细胞总数显著增加，产板巨核细胞数量显著降低，MPV显著降低(P<0.05)。与模型组比较，黄芪多糖各组和泼尼松组大鼠巨核细胞总数减少、产板巨核细胞数显著增加，MPV显著升高(F=12.086、13.051、18.265，P<0.001)。与泼尼松组比较，黄芪多糖800 mg/kg组产板巨核细胞数、MPV差异无统计学意义(P>0.05)，见图1、表2。

2.3 各组大鼠血清炎性因子表达量比较 与空白对照组比较，模型组IL-1β、IL-8、TNF-α含量显著升高(P<0.05)。与模型组比较，黄芪多糖各组和泼尼松组IL-1β、IL-8、TNF-α显著降低(F=15.028、14.581、16.082，P均<0.001)。与泼尼松组比较，黄芪多糖800 mg/kg组血清炎性因子水平差异无统计学意义(P>0.05)，见表3。

2.4 各组大鼠肺组织TLR4、NF-κB蛋白水平比较 与空白对照组比较，模型组TLR4、NF-κB蛋白表达显著增加(P<0.05)。与模型组比较，黄芪多糖各组和泼尼松组TLR4、NF-κB蛋白表达显著降低(P<0.05)；与泼尼松组比较，黄芪多糖800 mg/kg组TLR4、NF-κB蛋白的表达差异无统计学意义(P>0.05)，见图2。

表3 各组大鼠血清炎性因子水平比较

注：与空白对照组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05；与泼尼松组比较，cP>0.05

图1 各组大鼠骨髓巨核细胞形态(钙盐染色，×400) 表2 各组大鼠骨髓巨核细胞及MPV比较

组 别n巨核细胞总数(个/mm2)产板巨核细胞数(个/mm2)MPV(fl)空白对照组1054.20±3.6816.20±2.557.67±0.49模型组1085.60±6.09a2.50±0.63a6.21±0.55a泼尼松组1058.70±5.16b15.30±3.05b7.52±0.38b黄芪多糖400 mg/kg组1071.90±5.39b5.70±2.56b6.48±0.40b黄芪多糖600 mg/kg组1066.02±3.66b10.80±2.53b7.02±0.36b黄芪多糖800 mg/kg组1061.11±4.97bc14.70±2.91bc7.22±0.41bcF值12.08613.05118.265P值<0.001<0.001<0.001

注：与空白对照组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05；与泼尼松组比较，cP>0.05

注：与空白对照组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05；与泼尼松组比较，cP<0.05

图2 各组大鼠肺组织TLR4/NF-κB信号通路蛋白表达比较

2.5 各组大鼠肺组织IL-1β、IL-8、TNF-α mRNA表达量比较 与空白对照组比较，模型组IL-1β、IL-8、TNF-α mRNA表达显著增加(P<0.05)。与模型组比较，黄芪多糖各组和泼尼松组IL-1β、IL-8、TNF-α mRNA表达显著降低(P<0.05)。与泼尼松组比较，黄芪多糖800 mg/kg组IL-1β、IL-8、TNF-α mRNA表达差异无统计学意义(P>0.05)，见图3。

注：与空白对照组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05；与泼尼松组比较，cP<0.05

图3 各组大鼠肺组织IL-1β、IL-8、TNF-α mRNA表达比较

2.6 人巨核细胞株Meg-01分化标记物CD41、GPIba表达量比较 与对照组比较，IL-1β组、IL-8组、TNF-α组巨核系Meg-01细胞CD41、GPⅠba的表达显著下调，其中TNF-α下调幅度最大(F=21.620，P<0.001)；TPO组巨核系Meg-01细胞CD41、GPⅠba的表达上调(F=15.231，P<0.001);与对照组比较,黄芪多糖组细胞CD41、GPⅠba的表达差异无统计学意义(t=0.869，P=0.123)，见图4。

注：与对照组比较，aP<0.05，bP<0.01图4 各组Meg-01巨核细胞 CD41、GPⅠba的表达

3 讨 论

平均血小板体积(MPV)是反映血小板活化程度的指标，在急性心肌梗死、高胆固醇血症、糖尿病、高血压和阻塞性睡眠呼吸暂停综合征等具有指导意义，已成为国内外研究的热点[7-9]。由于MPV的变化可反映感染、炎性反应、免疫等慢性病严重程度[10-11]，近年来MPV评估COPD病情严重程度的研究也逐渐增多[12]。COPD患者由于肺血管收缩、血流减慢，常存在缺氧、感染、酸中毒等症状，大量中性粒细胞和巨噬细胞聚集，使局部及全身炎性反应水平加重[13-16]。

肺主呼吸，朝百脉，汇聚气血。气虚、血瘀是引发肺病的重要病理基础，肺气亏虚是COPD病机之本。黄芪补气升阳、利水消肿，其主要活性成分之一黄芪多糖，具有调节机体免疫功能、抑制细胞分泌炎性因子的作用[17]，对LPS诱导的炎性反应有明显抑制作用[18]。为探究黄芪多糖对COPD的改善作用，分别给予COPD大鼠黄芪多糖400、600、800 mg/kg灌胃，以泼尼松为阳性药对照，结果发现与模型组比较，给予黄芪多糖各组大鼠相关炎性因子IL-1β、IL-8、TNF-α及TLR4/NF-κB通路关键蛋白水平显著降低。

IL-8、TNF-α在COPD炎性反应进程中发挥着重要作用[19-20]，是气道炎性因子网络的重要组成部分。IL-1β作为前炎性介质因子，一方面能够激活免疫细胞，介导T、B细胞活化、增殖与分化；另一方面促进中性粒细胞溶体酶的释放，产生大量氧自由基，促进IL-1、IL-6等炎性介质释放，加重炎性反应。在COPD气道及全身炎性反应中，IL-1β、IL-8、TNF-α基因转录与表达受上游NF-κB核转录因子的调节[21]。齐咏[22]、孙雪皎等[23]研究发现，稳定期重度COPD患者血清IL-8、TNF-α、NF-κB表达显著高于空白对照组。生理条件下，NF-κB主要以p65/p50二聚体形式存在细胞质中与抑制蛋白I-κBα结合成无活性的三聚体。当细胞受到外界刺激，I-κB激酶被激活后，使I-κBα被磷酸化后发生泛素化而被蛋白酶体降解。由于I-κBα对p65/p50二聚体抑制作用解除，p65/p50二聚体NLS暴露而被转入核内，激活下游炎性基因。

为进一步明确黄芪多糖是否直接对骨髓巨核细胞有直接促成熟作用，取人巨核细胞株Meg-01细胞株进行实验，以TPO为阳性对照，CD41和GPⅠba表达水平作为观察指标。TPO是调节巨核细胞分化和生成血小板的关键因子[24]。CD41被认为是巨核细胞或血小板特有的标志[25]；GPⅠba是巨核细胞向血小板分化过程中，血小板表面逐渐增加的糖蛋白，对参与血小板黏附等生理功能起重要作用，对GPⅠba表达分析有助于识别巨核细胞的分化程度[26]。结果表明黄芪多糖先抑制炎性因子的表达，炎性因子再促进骨髓巨核细胞的成熟，表明如何有效抑制炎性因子是未来治疗COPD的重要研究方向，同时炎性因子表达水平也是将黄芪多糖运用于临床时评估疗效的重要指标。

综上所述，黄芪多糖通过抑制TLR4/NF-κB通路减轻COPD大鼠炎性反应并使MPV升高，而MPV随着炎性反应剧烈程度的增加而降低，通过MPV可有效评估COPD炎性反应的严重程度。