IL-27在重症肌无力患者血清中的表达及与AChR抗体的相关性分析

冯苏 潘婧 梁翠娟 赵东兰

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择本院2015年1月至2016年12月收治的109例MG患者(MG组)，其中男53例，女56例；平均年龄(48.46±6.32)岁。MG患者按照疾病类型按照以下几种分组方法：分为眼肌型和全身型；根据CT结果或病理表现分为无胸腺异常、胸腺瘤和胸腺增生；胸腺异常的AChR抗体阳性与阴性组MG患者；发病年龄≤50岁为早发病期的Mg患者和患者发病年龄>50岁为晚发病期的Mg患者[11]。选取115例同期在本院进行健康体检的表观健康者作为健康对照组，排除自身免疫性疾病、癌症和感染性疾病的历史，其中男54例，女61例；年龄25～50岁，平均年龄(46.20±4.36)岁。2组患者年龄、性别比及病情等比较差异均无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2 入组与排除标准 入组标准(4个标准中的任何2项，但必须包括标准1)：(1)波动性疲乏和疲劳；(2)重复神经刺激试验；(3)抗胆碱酯酶药物敏感；(4)抗乙酰胆碱受体结合或阻断抗体。排除免疫抑制治疗史的患者。

1.3 标本采集 早晨空腹时无菌采集肘静脉血5 ml，用肝素对静脉血抗凝并摇匀，3 000 r/min低温离心10 min，分离上层血清置于EP管中于-80℃冰箱中保存，并于测定时恢复室温通过酶联免疫吸附试验(ELISA)测定血清IL-27浓度水平。

1.4 所用试剂及检测方法 欣博盛 QuantiCyto ELISA试剂盒(试剂批号：H180608-014a)采用双抗体夹心法：抗人IL-27单抗包被于酶标板上，标本和标准品中的人IL-27会与单抗结合，游离的成分被洗去。加入生物素化的抗人IL-27抗体和辣根过氧化物酶标记的亲和素，生物素与亲和素特异性结合；抗人IL-27抗体与结合在单抗上的人IL-27结合而形成免疫复合物，游离的成分被洗去。加入显色底物，若反应孔中有人IL-27，辣根过氧化物酶会使无色的显色剂呈现蓝色，加终止液变黄。在450 nm处测OD值，人IL-27浓度与OD450值之间呈正比，可通过绘制标准曲线求出标本中人血清IL-27的浓度。

1.5 治疗方法 MG患者给予糖皮质激素中等剂量冲击并小剂量维持治疗。开始时予醋酸泼尼松1 mg/kg,口服，1次/d。4～8周后待症状缓解后减量至原量的2/3，从每日顿服到隔日清晨顿服，后每2～4周减量 2.5～5.0 mg，直到减至能控制症状的最小有效剂量 5～15 mg/d维持，每日或隔日清晨顿服。疗程为6个月。

2 结果

2.1 健康对照组和MG组血清中IL-27水平比较 MG组的血清IL-27水平为(282.02±81.03)pg/ml，显著高于健康对照组(206.91±31.84)pg/ml，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

组别IL-27健康对照组(n=115)206.91±31.84MG组(n=109) 282.02±81.03∗

注：与健康对照组比较，*P<0.001

2.2 不同MG患者分组的血清IL-27水平比较 在36例眼肌型和73例全身型MG患者中，血清IL-27浓度水平分别为(228.33±56.26)pg/ml和(307.46±62.79)pg/ml。全身型MG患者的血清IL-27水平显著高于对照组(P<0.05)。其中77%的MG患者血清中AChR抗体阳性(80/104，5例患者未进行抗体测试)，其血清IL-27浓度水平为(292.35±74.28)pg/ml，血清AChR抗体阴性患者血清IL-27浓度水平为(277.93±80.15)pg/ml，AChR抗体阳性的MG患者与健康对照组的IL-27浓度水平有差异(P<0.05)。当MG患者按年龄分类时，72例早发病和37例晚发病MG患者的血清IL-27水平分别为(392.80±106.56)pg/ml和(217.45±43.84)pg/ml，早发病MG患者的血清IL-27水平显著高于健康对照组(P<0.001)，而晚发病MG患者的水平与健康对照组无差异(P>0.05)。见表2。

2.3 不同胸腺状态的MG患者血清IL-27水平 109例MG患者中有20例患有胸腺瘤，12例MG患者同时患有胸腺增生，2组MG患者血清IL-27浓度水平分别为(237.52±29.98)pg/ml和(951.57±237.04)pg/ml，而另外67名没有胸部CT异常的患者血清IL-27水平为(301.58±53.86)pg/ml。因此，无胸腺异常和胸腺增生患者的IL-27浓度水平均明显升高，且具有显著性差异(P<0.001)，但胸腺增生的MG患者血清IL-27浓度水平尤其升高明显。见表3。

MG患者分组血清IL-27水平眼肌型(n=36)228.33±56.26全身型(n=73)307.46±62.79∗AChR抗体(-)(n=24)277.93±80.15AChR抗体(+)(n=80)292.35±74.28∗早发病(n=72)392.80±106.56#晚发病(n=37)217.45±43.84

注：与眼肌型和AChR抗体(-)比较，*P<0.05；与晚发病比较，#P<0.01

胸腺状态血清IL-27水平无胸腺异常(n=67)301.58±53.86∗胸腺瘤(n=20)237.52±29.98胸腺增生(n=12)951.57±237.04∗

注：与胸腺瘤比较，*P<0.001

2.4 AChR抗体阳性的MG患者AChR抗体水平与血清IL-27浓度的相关性分析 将80例AChR抗体阳性的MG患者血清AChR抗体水平和其血清IL-27浓度水平进行相关性分析。结果发现，AChR抗体阳性的MG患者血清IL-27水平与AChR抗体水平呈正相关，相关系数r=0.792，且差异有统计学意义(P<0.001)。见图1。

图1 AChR抗体阳性的MG患者AChR抗体水平;与血清IL-27浓度的相关性分析(r=0.792，P<0.001)

2.5 AChR抗体阳性的MG患者激素治疗后血清IL-27降低水平与AChR抗体降低水平相关性分析 将53例AChR抗体阳性的MG患者激素治疗后血清AChR抗体降低水平和其血清IL-27浓度降低水平进行相关性分析。结果发现，血清IL-27降低水平与AChR抗体降低水平呈现正相关，相关系数r=0.579，且具有统计学意义(P<0.05)。见图2。

3 讨论

图2 激素治疗后MG患者AChR抗体降低水平;与血清IL-27浓度降低水平的相关性分析(r=0.579，P<0.05)

此外，本研究亚组分析显示，广义MG患者和早发病MG患者的血清IL-27浓度水平也明显高于对照组(P<0.05)；而晚发病MG患者血清IL-27水平虽较健康对照组稍高，但无统计学意义。以上研究结果可能与机体早期抵抗抗原攻击时，IL-27高表达并通过胞外信号调节激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase1/2，ERK1/2)信号通路促进干扰素λ1(interferon λ1，IFN-λ1)分泌，保护机体抗炎有关[14]。

MG患者中约有10%～15%的患者合并胸腺瘤，80%的患者同时伴有淋巴滤泡增生、胸腺肥大等[15]。调节T细胞介导的免疫调节和免疫细胞的异常募集是负责维持MG患者胸腺中AChR抗体的炎症和免疫应答的可能机制[16]。胸腺异常的MG患者，源自APC的IL-27诱导T细胞中干扰素-γ(IFN-γ)的产生，IFN-γ反过来对APC发挥作用并上调IL-27表达，导致针对胸腺肌样细胞的自身反应性T细胞大量增生，诱发胸腺增生或胸腺瘤，该T细胞迁移至靶器官，最终导致MG的发病[17]。Berrih-Aknin等已证明胸腺B细胞在AChR抗体的产生中具有重要作用[18]，由此推断IL-27可能与MG早发病机制中的胸腺滤泡增生和胸腔内自身抗体的产生有关。本研究中胸腺增生的MG患者血清IL-27浓度水平明显高于无胸腺异常组和胸腺瘤组，表明IL-27/IFN-γ可能存在永久性的炎症闭环，导致胸腺滤泡的不断增生，从而在不同的病理表现阶段发挥促炎抗炎和抗肿瘤等作用。

MG发病机制从临床免疫学角度理解为某些致病因子破坏机体的免疫平衡状态，重新激活抗原特异性的T细胞，从而辅助体内B细胞执行体液免疫，产生重症肌无力特异性抗体AChR抗体[19]。诸多证据表明，患者体内的AChR抗体浓度即便很低，AChR抗体阴性，临床症状也可有明显表现，因此细胞分泌的抗AChR抗体浓度与病情严重程度并无关系，而同一病人血浆中抗体水平的变化却与病情严重程度密切相关[20]。本研究结果80例AChR抗体阳性的MG患者体内IL-27浓度水平高于AChR抗体阴性患者，且具有统计学差异(P<0.001)，提示IL-27可能通过调节T细胞介导的体液免疫和诱导B细胞产生的AChR抗体在MG发病中发挥作用。同时本研究数据表明，AChR抗体阳性的MG患者体内IL-27浓度水平与其特异性抗体AChR抗体呈现明显正相关性(P<0.001)，即随患者体内IL-27浓度水平增高AChR抗体也有增高趋势，推断在MGAChR抗体阳性的患者体内IL-27对其特征性抗体AChR抗体发挥正向调节作用。糖皮质激素治疗后患者体内IL-27浓度水平显著降低，且其降低水平亦和AChR抗体降低水平呈现明显相关性(P<0.05)。激素治疗有效的机制可能是由于糖皮质激素抑制了APC表面的CD86和CD80等共刺激分子的表达以及CD83诱导的TNF-α、IL-6和IL-12等细胞因子的释放，因此可认为糖皮质激素强烈干扰了APC的分化和成熟，从而导致IL-27的低表达及AChR抗体相应浓度水平的下降[17]。

综上，研究结果表明IL-27可能在MG免疫调节及发病机制中起重要作用，尤其在具有胸腺增生的AChR抗体阳性早发型MG亚型中更有其重要意义。通过对不同临床表型的MG患者血清IL-27浓度水平及其与MG特征性抗体AChR抗体的相关性分析，及早抑制IL-27在MG发病机制中的异常免疫反应，从而为MG的临床诊断和治疗提供新的思路。