基于网络药理学和分子对接探讨鸡血藤治疗糖尿病肾病的作用机制研究

王蓉,林栩▲,吴昱升,黄慕源,徐璐瑶,张洁

(1.右江民族医学院附属医院肾内科,广西百色 533000;2.广西免疫相关性疾病医学科研基础保障重点实验室,广西百色 533000)

糖尿病肾病(diabetic kidney disease,DKD)是一种慢性肾脏疾病,发生在糖尿病(diabetic mellitus,DM)患者身上,持续性蛋白尿和肾功能不全是DKD的主要临床特征[1-2]。DKD已被公认为糖尿病的严重并发症和终末期肾病的主要致病因素,给人类带来了严重的健康问题和巨大的经济负担[3]。在DKD的治疗中,传统的治疗方法,如减肥和控制血糖,在许多临床环境中可能无法提供令人满意的结果。然而,应该注意的是,中药具有多种功能,在临床上有可能作为治疗DKD的主要或替代疗法。 对中药中生物活性物质的鉴定及其肾脏保护作用的分子机制的研究正变得越来越活跃。因此,从中药资源中寻找有效药物具有重要意义。

糖尿病肾病是一种慢性疾病,需要活血通络、抗氧化来减轻临床症状,预防并发症,延缓疾病的进展。鸡血藤为豆科植物,性温,味苦,是活血化瘀药物,具有改善造血系统、调节脂质代谢、抵抗肿瘤和调节免疫等生物活性,而且含有多种多酚类,具有较强的自由基清除活性和抗氧化作用,是一种很有前途的活性氧相关病理治疗药物[4-5]。近年来,鸡血藤的多种药理作用已被广泛用于临床治疗。网络药理学是一种在系统水平上预测化合物有效成分和疾病靶点的组成,建立药物-成分-靶点-疾病等多层次网络的方法。此外,分子对接是一种研究蛋白质受体与小分子配体之间相互作用和识别的理论方法,能够预测结合模式和亲和力强度[6]。总之,网络药理学和分子对接可以互补地用于中医药研究,为活性化合物筛选和机理探索提供新的见解,已成为揭示中药与疾病之间复杂网络关系的有效工具。本研究通过数据挖掘和分析,应用网络药理学和分子对接,筛选和预测DKD治疗中鸡血藤活性成分的潜在靶分子和信号通路。研究结果从分子层面阐释治疗DKD的机制,为鸡血藤进一步研究提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 数据库及网址数据库名称及网址见表1。

表1 数据库及网址

1.2 收集和筛选鸡血藤活性成分及作用靶点运用TCMSP数据库检索鸡血藤的所有化合物成分,筛选出口服生物利用度(oralbioavailability,OB)≥30%,类药物(drug like,DL)≥0.18的鸡血藤中的活性化合物[6]。通过TCMSP数据库获取鸡血藤活性成分对应的潜在作用靶点信息。

1.3 DKD相关靶点的筛选以 “diabetic nephropathy ”“diabetic kidney disease” 为关键词,搜索GeneCards、OMIM、PharmGkb、TTD和DrugBank数据库以获得DKD全部的靶点信息。

1.4 活性成分-靶点-疾病网络构建为明确DKD相关靶点与鸡血藤活性成分之间的相互作用,使用Venny 2.1.0将疾病靶点和药物靶点交叉,以确定共同的靶点,并创建一个韦恩图。该图被导入Cytoscape 3.8.0以构建“鸡血藤-共有靶点”网络。

1.5 蛋白相互作用网络构建将获取的鸡血藤治疗DKD的潜在作用靶点输入到STRING 数据平台,选项设为“Multiple proteins”,选择置信度≥0.4,设置隐藏游离点,构建蛋白质相互作用(protein-protein interaction,PPI)网络。使用CytoNCA工具来分析网络中心性(NC)、度中心性(DC)、接近中心性(CC)、局部边连通性(LAC)、介度中心性(BC)及特征向量中心性(EC)等参数,将所有上述参数高于各自中位数的节点从关键网络节点中过滤出来。剩下的节点被确定为DKD治疗的关键靶标。

1.6 GO功能分析和KEGG信号通路富集分析按P值及校正后的P值(q值)均<0.001为基准进行GO功能与KEGG通路富集分析,从而得出鸡血藤治疗DKD参与的生物学过程和作用。

1.7 分子对接①从PubChem 数据库下载活性成分的化合物作为配体分子。②从RCSB PDB 数据库获得蛋白质受体3D结构作为受体分子。③使用AutoDockvina软件进行小分子配体和蛋白质受体的分子对接[6]。使用Pymol软件对化合物和蛋白质的对接结果进行分析。

2 结 果

2.1 筛选关键活性化合物通过对几个数据库的搜索和筛选,收集了鸡血藤的24个关键活性化合物,结果见表2。

表2 鸡血藤活性成分的基本信息

2.2 DKD靶点对GeneCards、OMIM、PharmGkb、TTD和DrugBank数据库的搜索分别发现了15 640、485、220、26和102个DKD相关靶点,剔除重复后得到12 818个DKD相关靶点,结果见图1。

图1 数据库收集DKD相关靶点

2.3 成分-靶点-疾病网络构建将鸡血藤活性成分靶点与DKD靶点输入到Venny 2.1.0软件绘制韦恩图,两者取交集后获得疾病-药物成分共有靶点48个,见图2A。Cytoscape 3.8.0也被用来将活性成分与靶点结合,构建“活性成分-靶点”网络(图2B),表明鸡血藤通过多成分-多靶点整体发挥治疗DKD作用。

注:A为靶点-疾病靶点韦恩图;B为“活性成分-靶点”网络

2.4 关键靶点PPI 网络的构建与分析将Venny 2.1.0 软件筛选出的48个共同靶点输入在线STRING 网站,物种设置为“人”,构建PPI 网络(图3),PPI网络被导入Cytoscape 3.8.0,使用CyoNCA插件进行重建和2次筛查后,共获得4个核心靶点基因,分别为热休克蛋白90 Alpha 家族A级成员1(HSP90AA1)、MYC 原癌基因(MYC)、肿瘤蛋白p53(TP53)、信号传感器和转录激活剂3(STAT3),拓扑参数BC、CC、DC、EC、LAC、NC皆大于各自中位数0.894,0.933,13,0.264,10.5,12.211。表明这4个关键基因以已知、预测或其他相互作用而相互影响,同时也是鸡血藤治疗DKD的核心靶点。结果见图4。

图3 蛋白之间的相互作用网络(PPI)

图4 PPI网络中关键靶点基因的筛选流程

2.5 GO功能富集和KEGG信号通路富集分析GO功能富集分析共检测出498个条目:440个生物过程(BP),25个细胞组成(CC)和33个分子功能(MF)。见图5。KEGG通路富集分析共得到61个条目,包括PI3K-Akt信号通路和p53信号通路等。见图6。

图5 GO功能富集分析 图6 KEGG 通路富集分析

2.6 分子对接技术验证活性成分与核心基因的相互作用分子对接分析了4个核心靶点基因和从活性成分-靶点网络中获得的3种化合物,结果见图7。芦荟大黄素与TP53结合能为-7.5,木犀草素与TP53的结合能为-7.9,甘草查尔酮a与HSP90AA1的结合能为-7.9,木犀草素与HSP90AA1的结合能为-8.5,芦荟大黄素与MYC的结合能为-5.5,甘草查尔酮a与STAT3的结合能为-7.3,芦荟大黄素与HSP90AA1的结合能为-8.8,芦荟大黄素与STAT3的结合能为-6.9,木犀草素与MYC的结合能为-6.0,木犀草素与STAT3的结合能为-7.3,甘草查尔酮a与TP53的结合能为-9.2,甘草查尔酮a与MYC的结合能为-5.7。见表3。结果显示,所有的组合都表现出良好的结合活性,其结合能低于-5 kcal/mol。一些组合还显示出很强的结合活性,结合能低于-7 kcal/mol。这些结果表明,鸡血藤的主要活性成分与DKD的主要靶基因之间有很强的相关性,表明这些有效活性成分和主要靶点基因可能是鸡血藤治疗DKD的主要活性靶点。

表3 鸡血藤活性化合物与核心靶点的对接结果

3 讨 论

DKD是终末期肾病(ESKD)的最重要病因,其开始是微量白蛋白尿,随后是大量白蛋白尿,然后肾功能逐渐下降,并通过特征性病理表现进行病理学诊断,例如系膜底物增加、结节性病变和肾小管间质纤维化[7]。DKD的发病机制包括肾小球高血压、肾血流动力学改变、缺血和缺氧、氧化应激和肾素-醛固酮系统的上调[8]。然而,该疾病的全部发病机制仍有待了解,治疗靶点尚未确定。

本研究采用网络药理学初步探索了鸡血藤治疗DKD的分子机制。通过网络拓扑分析筛选出鸡血藤作用于心血管疾病的前4个基因为关键基因,即 HSP90AA1、 TP53、STAT3、MYC。这些基因可能在DKD的发生和发展中起重要作用。HSP90AA1是一种普遍表达的分子伴侣,参与促进癌细胞存活的突变和过表达信号蛋白的稳定性[9],它在多种癌症中上调,HSP90AA1 水平升高提示预后不良,被认为是恶性转化和进展的必要条件。另有研究表明HSP90AA1是自噬的重要调节剂,可通过PI3K/Akt/mTOR途径和JNK/P38途径促进自噬并抑制细胞凋亡[10]。TP53是一种关键的肿瘤抑制因子,在癌症的发生发展和治疗中起着多方面作用。TP53蛋白的活化可导致多种细胞反应,包括细胞凋亡、细胞衰老、细胞周期停滞、DNA修复、代谢适应。TP53介导的转录调节根据应激刺激的类型和细胞的类型而变化,例如,轻微的DNA损伤可能导致细胞周期停滞并激活DNA修复机制,而较强的TP53激活信号会诱导衰老或凋亡[11]。转录调节剂STAT3是STAT(信号传感器和转录激活剂)家族的成员,参与许多生物学过程,包括细胞增殖、存活、分化和血管生成[12],在正常细胞中,STAT3的瞬时激活(主要通过磷酸化)将转录信号从质膜上的细胞因子和生长因子受体传递到细胞核[13]。核STAT3通过转录调控几种自噬相关基因(如BCL2家族成员和具有自噬调节剂靶标的微RNA)来微调自噬,细胞质STAT3通过隔离EIF2AK2以及通过与其他自噬相关的信号分子(如FOXO1和FOXO3)相互作用来抑制自噬[14]。此外,STAT3介导由细胞内蛋白如活化的Ras或酪氨酸激酶癌蛋白引发的重要信号转导级联反应[15],在抑制关键免疫激活调节因子的表达和促进免疫抑制因子的产生方面起重要作用。MYC是一种多效性转录因子,可调节关键细胞过程,包括增殖、分化、细胞周期、代谢和凋亡[16]。MYC是一个编码核磷蛋白的原癌基因,参与细胞周期的进展、细胞凋亡和细胞转化。MYC癌基因家族包括C-MYC、N-MYC 和L-MYC,它们在发育过程中显示出不同的表达时机和组织特异性,C-MYC在组织发育和各种肿瘤中普遍表达,N-MYC在神经组织和早期造血发育中表达,L-MYC在肺部表达,特别是在小细胞肺癌中过度表达,目前被认为具有较低的转化活性[17-19]。

本研究中,GO功能富集分析共得到498个条目,分子功能主要涉及泛素样蛋白连接酶结合、G 蛋白偶联胺受体活性等;生物学过程主要涉及对膜电位调节、细胞对肽的反应、肾上腺素受体信号通路等;细胞组成主要涉及膜筏、膜微区、蛋白激酶复合物等。KEGG通路富集分析共得到61个条目,包括PI3K-Akt和p53等信号通路。分子对接方法的验证表明,鸡血藤的主要活性成分与DKD的主要靶基因之间有很强的关联性。然而,目前没有关于核心靶点与DKD之间相关性的报道,本研究中探讨的鸡血藤在DKD治疗中的潜在靶点基因和信号通路还需要通过适当的实验进一步证实。

综上所述,鸡血藤中的活性成分可以作用于HSP90AA1、TP53、STAT3和MYC等靶基因,并调节PI3K-Akt和p53等信号通路,发挥对DKD的治疗作用。本研究从网络药理学的角度预测了鸡血藤治疗DKD的作用机制,表明鸡血藤在治疗DKD中表现出多成分、多靶点和多途径的特性,为进一步研究其分子机制提供了基础。