lncRNA GAS6-AS1在子宫内膜癌中的表达与临床病理特征和预后因素分析

王杉杉,张圆圆

(河南大学第一附属医院妇科,河南开封475004)

子宫内膜癌是发生于子宫内膜上皮的妇科癌症。近年来,随着人们压力和生活方式的改变,子宫内膜癌的发病率逐渐增加[1]。尽管子宫切除可治疗子宫内膜癌,但子宫内膜癌术后复发和转移仍影响患者预后[2-3]。寻找子宫内膜癌相关标志物预测疾病发展的临床特征同时为今后治疗提供可能的治疗靶点值得关注。长链非编码RNA生长阻滞特异性基因6反义RNA 1(long noncoding RNA growth arrest specific 6 antisense RNA 1,lncRNA GAS6-AS1)是一种长链非编码RNA,在恶性肿瘤细胞侵袭、迁移中扮演关键作用[4-5]。ZHANG等[6]研究显示lncRNA GAS6-AS1在胃癌组织中上调,且高表达GAS6-AS1可通过促进细胞进入S期来提升胃癌细胞增殖、迁移、侵袭能力。但目前lncRNA GAS6-AS1在子宫内膜癌的作用研究尚不知晓。本文拟探讨子宫内膜癌患者癌组织中lncRNA GAS6-AS1表达变化,并分析其与子宫内膜癌临床病理特征及患者预后的关系,期望日后可为评估子宫内膜癌预后提供有价值的参考依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料回顾性分析2015年6月至2018年1月于河南大学第一附属医院行子宫切除的80例子宫内膜癌患者,患者年龄35～76岁,平均(54.18±11.67)岁;在子宫切除术中收集子宫内膜癌组织以及距离癌组织边缘5 cm以上的癌旁组织,组织样品获取后迅速置于液氮冷冻、备用。收集的子宫内膜癌组织及癌旁组织均经病理实验证实。纳入标准:①均行手术治疗,经病理检查确诊为子宫内膜癌;②术前未进行激素药物治疗、局部或全身化疗、放疗;③首次发病。排除标准:①患其他肿瘤、肝肾功能障碍;②合并急慢性炎症、其他妇科疾病;③患全身感染性疾病、免疫系统疾病;④子宫、卵巢双发癌,无法确定原发病灶。本研究通过河南大学第一附属医院伦理委员会批准。

1.2 检测子宫内膜组织中lncRNA GAS6-AS1表达水平将获得的组织放入研钵中研磨,加入TRIzol试剂(武汉科昊佳生物科技有限公司)裂解组织,倒入EP管中,加入等体积的氯仿振荡混匀,然后离心(14 000 r/min,30 min),收集上层上清移入新的无RNA酶的EP管中,加入等体积的异丙醇然后离心(12 000 r/min,25 min),收集沉淀,加入1 mL的无水乙醇悬浮沉淀,然后离心(14 000 r/min,20 min),得到RNA,加入DEPC水在4 ℃溶解RNA。依据RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(南京赛泓瑞生物科技有限公司)说明书反转录得到cDNA。以cDNA为模板,采用7300型实时荧光定量PCR仪(美国ABI公司)对lncRNA GAS6-AS1及内GAPDH进行扩增反应。反应条件:95 ℃,3 min;95 ℃,30 s;59 ℃,30 s;72 ℃,30 s;40个循环。反应结束后收集数据,并对所得数据Ct值进行分析,用2-CT法计算lncRNA GAS6-AS1相对表达量。lncRNA GAS6-AS1、GAPDH引物由南京金斯瑞生物工程有限公司合成,引物设计见表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3 随访从子宫内膜癌患者手术切除术后以电话或门诊方式随访,随访内容包括妇科盆腔检查、阴道B超、胸部X线检查,必要时行CT或磁共振成像检查。最长随访时间为5年,随访至2021年12月,记录患者生存时间、总生存期(overall survival,OS),OS为开始治疗到死亡或失访的时间。预后不良包括患者死亡。80例子宫内膜癌患者,存在33例删失数据。

1.4 治疗方法Ⅱ期、Ⅲ期子宫内膜癌患者化疗方案:(135～175 mg/m2)的紫杉醇(国药准字:H20063787,悦康药业集团股份有限公司)溶于500 mL生理盐水中,静脉滴入,d1;300 mg/m2的卡铂(国药准字:H10950273,云南植物药业有限公司)溶于500 mL生理盐水中,静脉滴入,d2;21 d为一个疗程,治疗4个疗程。

2 结 果

2.1 lncRNA GAS6-AS1在子宫内膜癌组织中的表达水平与癌旁组织相比,子宫内膜癌组织中lncRNA GAS6-AS1相对表达水平较高(P<0.001)。见表2。

表2 lncRNA GAS6-AS1在子宫内膜癌组织中的表达水平

2.2 lncRNA GAS6-AS1表达水平与患者临床病理特征的关系手术病理分期参照2009年FIGO分期标准[7],Ⅰ期+Ⅱ期52例,Ⅲ期28例;浸润深度≥1/2肌层33例,浸润深度<1/2肌层47例;盆腔淋巴结转移26例,无盆腔淋巴结转移54例;组织学分级:G1+G2 56例,G3 24例;病理分型:激素依赖型44例,非激素依赖型36例。根据lncRNA GAS6-AS1平均值(2.76)为截断值,将子宫内膜癌组织分为高表达组44例,低表达组36例,分析结果显示浸润深度≥1/2肌层、盆腔淋巴结转移子宫内膜癌组织lncRNA GAS6-AS1表达水平高于浸润深度<1/2肌层、无盆腔淋巴结转移子宫内膜癌组织(P<0.05)。见表3。

表3 lncRNA GAS6-AS1表达与子宫内膜癌患者临床病理特征的关系[n(%)]

2.3 子宫内膜癌组织中lncRNA GAS6-AS1相对表达水平与预后的关系Kaplan-Meier生存曲线显示,lncRNA GAS6-AS1低表达组5年累积总生存率为83.10%,平均生存期为(56.11±1.50)个月(95%CI:53.16～59.06),高表达组5年累积总生存率为60.00%,平均生存期为(47.44±2.58)个月(95%CI:42.38～52.50),差异有统计学意义(Log-rank=5.616,P=0.018)。见图1。

图1 子宫内膜癌患者5年随访期间Kaplan-Meier生存曲线

2.4 影响子宫内膜癌患者预后的危险因素分析以子宫内膜癌患者5年预后为因变量(预后不良=0,预后良好=1),将年龄(<60=0,≥60=1)、分化程度(高中分化=0,低分化=1)、FIGO分期(Ⅰ+Ⅱ=0,Ⅲ=1)、浸润深度(<1/2肌层=0,≥1/2肌层=1)、盆腔淋巴结转移(无=0,有=1)、lncRNA GAS6-AS1表达水平(低表达=0,高表达=1)作为自变量并赋值进行分析,单因素分析表明,浸润深度、盆腔淋巴结转移、lncRNA GAS6-AS1均是影响子宫内膜癌患者预后不良的危险因素。多因素分析表明,浸润深度≥1/2肌层、lncRNA GAS6-AS1高表达是子宫内膜癌患者预后不良的独立危险因素(P<0.05)。见表4。

表4 影响子宫内膜癌患者预后的危险因素分析

3 讨 论

子宫内膜癌是威胁女性生命的常见恶性肿瘤,其患者病死率仅次于卵巢癌和宫颈癌[8-9]。子宫内膜癌转移途径包括侵袭周围正常组织或通过血管、神经及淋巴管侵袭远处器官[10]。临床上除了手术治疗子宫内膜癌,还可用放疗、化疗等辅助治疗策略,但晚期子宫内膜癌患者治疗方案有限,导致预后较差。因此研究子宫内膜癌发展机制,对寻找新的治疗策略、改善患者预后有重要意义。

lncRNA是一种新型非编码RNA,在不同组织中均有表达,其在细胞周期、细胞凋亡及染色质重塑中发挥关键调节作用[11-12]。以往的研究显示,lncRNA在恶性肿瘤的发生中起关键作用,可作为癌症诊断、预后评估的生物标志物[13-14]。GAS6主要由肿瘤相关巨噬细胞和癌症相关成纤维细胞产生,具有与维生素K相关的γ-羧基谷氨酸结构域,通过该结构域与包含磷脂酰丝氨酸的蛋白质相互作用。GAS6的这种功能可调节肿瘤细胞生殖过程、血管生成过程和免疫反应过程。研究显示,在胰腺癌中GAS6表达水平降低会阻止肿瘤细胞发生上皮-间充质转化并激活自然杀伤细胞,从而阻碍肿瘤细胞转移[15]。GAS6-AS1是GAS6的反义方向转录。LAVASANI等[16]研究显示,GAS6-AS1可通过激活GAS6而促进乳腺癌细胞的侵袭性。LEI等[17]研究显示,GAS6-AS1在急性髓系白血病骨髓细胞中呈高表达,高表达GAS6-AS1可促进急性髓系白血病细胞迁移和侵袭,为治疗急性髓系白血病提供了新的治疗靶点。CHEN等[18]通过实时定量PCR检测结直肠癌组织和细胞系中GAS6-AS1表达水平,结果显示,GAS6-AS1在结直肠癌组织和细胞系中的表达水平均上调,并与结直肠癌患者的不良预后呈正相关,另外,GAS6-AS1可通过ceRNA网络和FUS依赖性方式促进TRIM14介导的结直肠癌细胞增殖、迁移、侵袭和上皮间质转化,提示GAS6-AS1可作为结直肠癌新的生物标志物和治疗靶点。本研究显示子宫内膜癌组织中lncRNA GAS6-AS1表达水平显著高于癌旁组织,且浸润深度≥1/2肌层、盆腔淋巴结转移的子宫内膜癌组织lncRNA GAS6-AS1表达水平高于浸润深度<1/2肌层、无盆腔淋巴结转移的子宫内膜癌组织,提示lncRNA GAS6-AS1参与子宫内膜癌的发生、发展。本研究Kaplan-Meier生存曲线显示,lncRNA GAS6-AS1低表达组子宫内膜癌患者5年累积总生存率高于lncRNA GAS6-AS1高表达组,提示lncRNA GAS6-AS1可能影响子宫内膜癌预后,本研究结果与CHEN等[18]研究报道类似,表明lncRNA GAS6-AS1高表达可能对子宫内膜癌预后不良的预测有贡献。推测lncRNA GAS6-AS1影响子宫内膜癌患者预后的可能原因是lncRNA GAS6-AS1可调控子宫内膜癌迁移和侵袭。本研究还发现lncRNA GAS6-AS1高表达是子宫内膜癌患者预后不良的独立危险因素,提示lncRNA GAS6-AS1可能是子宫内膜癌预后不良发生的影响因素。

综上所述,子宫内膜癌组织中lncRNA GAS6-AS1呈高表达,与子宫内膜癌盆腔淋巴结转移、浸润深度密切相关,lncRNA GAS6-AS1高表达与子宫内膜癌预后不良有关,有望成为预测子宫内膜癌预后不良的生物学指标。但本研究也有不足,纳入样本量有限,研究中心单一,后续仍需增加样本量验证lncRNA GAS6-AS1与子宫内膜癌的关系,并深入探讨lncRNA GAS6-AS1与子宫内膜癌发生机制及预后不良机制的关系。