VEGF对内皮抑素诱导的血管内皮细胞凋亡的抑制作用

马 颖,何援利

（南方医科大学珠江医院妇产科,广州510280）

子宫内膜异位症（endometriosis,EMs）是育龄期妇女的多发病,主要表现为痛经及不孕,危害严重。EMs虽是一种良性病,却具有易增生、浸润和复发的恶性特点,目前治疗效果有限[1-2]。有研究提示EMs与血管生成关系密切,抑制血管生成可以达到抑制病灶生长的目的。内皮抑素（endostatin,ES）是一种强效的抗血管生成物质,可诱导血管内皮细胞凋亡,但ES蛋白不稳定,需借助基因治疗发挥作用[3-4]。血管内皮细胞生长因子（VEGF）可抑制ES诱导的血管内皮细胞凋亡。为探讨血管生成在EMs中的作用,本研究构建了携带ES基因的重组腺病毒,体外感染脐静脉内皮细胞ECV-304并诱导其凋亡,同时观察VEGF对这一现象的抑制作用。

1 材料与方法

1.1 实验材料 Pshuttle-ES质粒由本科保存。大肠杆菌BJ5183、AAV293细胞株、ECV-304细胞由中山大学生命科学院提供。腺病毒AdEasy-1系统,包括骨架质粒pAdEasy-1及穿梭质粒pAdT rack-CMV。限制性内切酶PmeⅠ、PacⅠ为NEB公司产品；蛋白酶K为Sigma公司产品；质粒抽提试剂、DNA胶回收试剂盒为Omega公司产品；Trizol试剂盒、LipofectAMINE2000、DM EM培养基、RPM I-1640培养基为Gibco公司产品；Taq DNA聚合酶、T4DNA Ligase、限制性内切酶KpnⅠ、XbaⅠ为TaKaRa公司产品；鼠抗人内皮抑素单克隆抗体为Oncogene公司产品、辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记的羊抗小鼠IgG为中北京山生物工程公司产品。DNA序列测定由中山大学生命科学院测序中心完成。

1.2 方法

1.2.1 重组腺病毒Ad-ES的构建、包装、纯化、滴度及感染效率测定 以Pshuttle-ES质粒为模板,PCR扩增出ES片断（约650bp）,构建重组穿梭质粒pAdTrack-ES,在大肠杆菌BJ5183中构建重组腺病毒质粒pAd-ES。同法,制备出无外源基因插入的空载质粒pAd-T rack。pAd-ES转染85%～90%融合的AAV293细胞,约14d后收集细胞,-80℃、37℃反复冻融,收集腺病毒Ad-ES,经用氯化铯密度梯度离心纯化。终点稀释法测定病毒滴度（Titer）。同法得到空载腺病毒Ad-Track。以1×104密度接种ECV-304于6孔板,用感染复数（multiplicity of infection,MOI）分别为1、10、100的Ad-ES感染,48h后在荧光显微镜下计数绿色荧光蛋白（GFP）阳性细胞百分率,测定病毒的感染效率。

1.2.2 RT-PCR及Western blot检测ES的转录和表达 Ad-ES（MOI=100）感染85%～90%融合的ECV-304,72h后收集细胞,用Trizol试剂盒抽提总RNA,加入无RNase的DNaseⅠ37℃孵育10min后,于70℃灭活15min。用获得的RNA进行逆转录,取2μ L cDNA产物为模板进行ES基因的PCR扩增。同样将感染的细胞沉淀经 SDS-PAGE电泳及 Western blot检测；Ⅰ抗为鼠抗人内皮抑素单克隆抗体（1∶50）,Ⅱ抗为HRP标记的羊抗小鼠IgG（1∶100）,DAB法显色。

1.2.3 VEGF对ES诱导的ECV-304凋亡的抑制作用测定分组：（1）实验组为Ad-ES+VEGF（10ng/mL）组；（2）阴性对照组为Ad-ES组；（3）空白对照组为Ad-Track组。各组细胞感染72h后,用胰酶处理得到单细胞悬液。加入200μ L的RNase酶（1g/L）,37℃水浴30min,再加入800μ L的PI染色液4℃避光放置30min,用流式细胞仪检测凋亡细胞的特征性亚二倍体峰。各组细胞感染72h后加入Hochest 33258染液（7.5μ g/mL）避光染色15～20min；再用-20℃预冷的PBS清洗细胞2次,弃上清液,荧光显微镜观察核染色及凋亡小体的情况。10%甲醛（formalin）固定细胞20min,加入0.1g/L结晶紫染液染色30min,用10%冰醋酸2mL抽提,抽提液与双蒸水混匀,在酶标仪上读取590nm处吸光度值,绘制细胞生长曲线图。

1.3 统计学处理 采用SPSS10.0统计软件进行Dunnett t检验。

2 结果

2.1 重组腺病毒Ad-ES的包装过程 重组腺病毒质粒pAd-ES转染AAV293细胞16h后,在荧光显微镜下可见绿色荧光蛋白（GFP）表达,荧光逐渐增多增亮,转染后5～9d,细胞膨胀变圆,触角逐渐消失,荧光不再增加,部分细胞开始悬浮,呈串珠样改变,表明病毒的形成和扩增；约在转染后14d,大部分AAV293细胞胞体固缩、悬浮,见封3图1～4。

2.2 ES的转录和表达 Ad-ES感染的ECV-304细胞有ES片段的扩增,而空白对照组无特异性条带产生,表明插入的ES基因在mRNA水平能有效转录,见图5。以MOI=100的Ad-ES感染ECV-304,约20kD处有特异性条带,与ES蛋白的相对分子质量一致,证明Ad-ES在ECV-304中有效地的表达,见图6。

图5 RT-PCR检测ES在ECV-304细胞中的表达

图6 Western blot检测ES蛋白的表达

图7 流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况

图9 各组细胞生长曲线

2.3 各组细胞凋亡情况 Ad-ES感染ECV-304细胞72h后出现细胞凋亡特征性的亚二倍体峰,Ad-ES+VEGF组细胞凋亡减少,Ad-Track组未见明显细胞凋亡,见图7。Ad-ES感染ECV-304细胞72h后出现大量的凋亡小体,Ad-ES+VEGF组凋亡较少,Ad-Track组无明显凋亡,见封4图8。

2.4 各组细胞生长曲线 绘制不同处理时间的各组细胞生长曲线,Ad-ES组细胞增殖速度明显低于Ad-Track组和Ad-ES +VEGF组,而后两组细胞增殖速率相似,差异无统计学意义（P＞0.05）,见图9。

3 讨论

EMs是一种危害严重、治疗困难的多发病,其发病机制不明。多项研究提示,新生血管生成是异位内膜病灶存在与发展的前提,抗血管生成治疗有望成为治疗EMs的有效途径之一。

ES是一种强效的抗血管生成物,可诱导血管内皮细胞凋亡并抑制其迁移,但ES蛋白不稳定,必须借助基因治疗发挥作用。基因治疗的关键环节就是选择高效安全的基因载体,本研究采用的腺病毒AdEasy-1系统是一种高效安全的基因载体,其安全、遗传毒性低,控制转录复制单位E1基因和编码毒性产物E3基因已被剔除,故不会自身复制；感染率高,易繁殖,宿主广泛；不整合到宿主细胞的染色体中,因而不会带来严重的不良反应[5-7]。VEGF具有强大的促内皮细胞增殖、促血管生成作用,可对抗ES诱导的细胞凋亡作用。多项研究提示VEGF的过表达可能是导致EMs发生的重要因素[8]。

在本研究中,成功构建并在AAV293细胞中包装出携带ES基因的重组腺病毒Ad-ES,感染ECV-304细胞后,用RTPCR及Western blot检测到ES的转录和表达,细胞生长曲线及流式细胞术证实Ad-ES感染后的ECV-304细胞增殖速度明显下降并出现凋亡,如果同时加入VEGF,则细胞凋亡明显减少。提示ES能够改变ECV-304细胞的生物活性,使其凋亡增加,这可能是ES抑制血管生成的重要机制之一；而上述作用能够被VEGF所对抗,从另一个方面说明ECV-304细胞受ES影响而发生变化,为进一步研究EM s血管生成机制奠定了基础。

[1]朗景和.子宫内膜异位症的研究与设想[J].中华妇产科杂志,2003,38（8）：478-480.

[2]Nothnick WB.Endometriosis：in search of optimal treatment[J].Minerva Ginecol,2010,62（1）：17-31.

[3]Karamouzis MV,Moschos SJ.The use of endostatin in the treatment of solid tumors[J].Expert Opin Biol Ther，2009,9（5）：641-648.

[4]May K,Becker CM.Endometriosis and angiogenesis[J]. Minerva Ginecol,2008,60（3）：245-254.

[5]Sharma A,Tandon M,Bangari DS,et al.Adenoviral vector-based strategies for cancer therapy[J].Curr Drug ther,2009,4（2）：117-138.

[6]Hogg RT,Garcia JA,Gerard RD.Adenoviral targeting of gene expression to tumors[J].Cancer Gene Ther,2010,17（6）：375-386.

[7]Becker CM,Sampson DA,Rupnick MA,et al.Endostatin inhibits the growth of endometriotic lesions but does not affect fertility[J].Fertil Steril,2005,84Suppl 2：S1144-1155.

[8]Takehara M,Ueda M,Yamashita Y,et al.Vascular endothelial growth factor A and C gene expression in endometriosis[J].Hum Pathol,2004,35（11）：1369-1375.