重症急性胰腺炎大鼠胃窦肌间神经丛一氧化氮合酶阳性神经元的变化

重症急性胰腺炎（severe acute pancreatitis,SAP）是消化系统常见的危重症疾病之一。有研究表明肠神经系统（ENS）在胃肠动力衰竭中起一定作用。本研究拟测定大鼠胃排空率及胃窦肌间神经丛一氧化氮合酶（NOS）阳性神经元的数目变化,探讨SAP对胃窦肌间神经丛NOS阳性神经元的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 （1）动物：成年SD雄性大鼠30只（由桂林医学院动物实验室提供）,体质量220～250g。随机分为两组,假手术组10只,模型组20只。（2）试剂：牛磺胆酸钠（Sigma公司）,Anti-Human Neuronal Protein HuC/HuD（anti-HuC/HuD,MolecularProbes公司）,NOS1（R-20,Santa Cruz公司）,TRITC标记山羊抗兔IgG（H+L）、FITC标记山羊抗小鼠IgG（H+L）（北京中杉金桥生物技术有限公司）,酚红糊剂（0.4%酚红试液按每15mL加1g面粉的比例加热调成糊剂,天津科密欧化学试剂开发中心）,NaOH、Ba（OH）2·8H2O、ZnSO4广东汕头西陇化工有限公司）等。（3）仪器：解剖显微镜（stemi 2000-CS,SIP NO.MIC 00945,蔡司光学仪器上海国际贸易有限公司）,Olympus正置荧光显微镜（日本奥林巴斯仪器公司）,L1braS32PC紫外分光光度计（Biochrom公司）等。

1.2 方法

1.2.1 SAP模型的建立 造模前大鼠禁食24h,可自由饮水,术前4h禁水,予25%氨基乙酸4mL/kg腹腔内注射麻醉,开腹,辨认胰胆管及十二指肠乳头开口处；在肠系膜对侧肠壁上选一无血管区,用磨去针尖的四号半针头经十二指肠乳头开口处滑行探入胰胆管,顺其走向推进4～5mm后,用动脉夹夹住胰胆管开口处及近肝门部胆管,接微量泵逆行泵入5%牛磺胆酸钠（1mL/kg,0.1mL/min）2～3min,即可见胰腺充血、水肿、胰胆管扩张,停止泵入牛磺胆酸钠,维持8～10min后,松开动脉夹、拔针,将肠管复位,分层关腹；术后皮下补液（生理盐水10mL）。

1.2.2 胃排空率的检测 造模 24h后,灌入酚红糊（1mL/100g）,20min后处死大鼠,结扎胃贲门与幽门,取胃,顺胃大弯纵向剪开,在冷0.85%NaCl溶液中洗脱酚红糊分装于试管中,洗脱液6mL加0.3mol/L Ba（OH）2溶液和5%Zn-SO4溶液各2mL,充分混匀,3000r/min离心10min,取4mL上清液加入10%NaOH 0.5mL混合,用紫外分光光度计于560nm比色,测吸光度,即为胃中酚红吸光度（OD）值,计算胃酚红残留率,以胃酚红残留率为指标评价胃排空率。另取0.4%酚红1mL,加蒸馏水1mL,以10%NaOH 0.5mL的OD为标准值计算胃排空率（%）,胃排空率（%）=（1-样品OD560/标准OD560）×100%。

1.2.3 胃窦肌间神经丛标本的制作 （1）具体步骤：将剪开的胃再次用冰Kreb液冲洗干净,使浆膜面朝上,平铺并适当伸展固定于木板上,用Stefanini固定液4℃固定24h；PBS缓冲液冲洗后,将胃窦部修剪成约0.4cm×0.8cm大小,将浆膜、肌层一同撕下,去掉附着的斜行肌、环行肌纤维,充分暴露肌间神经丛,将标本贴附于载玻片上,即制成标本。（2）双重免疫荧光染色：将制备好的胃肌间神经丛标本用含0.5%Triton X-100、10%正常山羊封闭血清的PBS室温孵育30～60min；anti-HuC/HuD（10μ g/mL）4℃孵育 24h；NOS1（R-20，1∶100）4℃孵育24h；FITC标记山羊抗小鼠 IgG（1∶100）22℃孵育45min；TRITC标记山羊抗兔IgG（1∶200）22℃孵育45min；甘油封片。每一道程序后均用PBS洗涤3次,每次10min。（3）染色结果判断：用Hu蛋白为神经元标志物显示所有神经元,用NOS1（R-20）显示阳性神经元；用TRITC（红）、FITC（绿）标记的二抗显示不同的一抗；用荧光显微镜观察并计数各自阳性细胞数,计算每200个神经元细胞中NOS神经元阳性细胞所占百分比。

1.3 统计学处理 采用SPSS17.0统计软件进行数据分析。分别进行正态分布检验,然后进行t检验,数据以±s表示,检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 大鼠一般情况 假手术组大鼠一般状况较好,术后无死亡发生。模型组大鼠一般状况差,出现精神萎靡、反应迟钝、懒动、呼吸急促等表现,6h死亡2只,12h死亡5只,24h死亡11只。

2.2 两组大鼠胃排空率比较 见表1。

2.3 胰腺组织大体改变 模型组诱导10min胰腺呈现广泛被膜下出血水肿,24h胰腺组织广泛出血坏死,范围扩大,胰腺周围大网膜及腹膜有较多皂化斑点,腹腔内大量血性腹腔积液。术后剖腹见假手术组胰腺肉眼观察呈淡粉红色,颜色均匀一致。

2.4 组织病理学观察 模型组胰腺腺泡细胞肿胀,可见灶性坏死,腺泡细胞间有大量炎细胞浸润；小叶排列紊乱,其间充斥炎性渗出；坏死区内腺泡结构消失；叶间隙增宽,间质微血管破裂,红细胞溢出。假手术组除部分胰腺腺泡细胞水肿外,小叶结构存在,间质清晰,间质内偶见炎细胞浸润,见表1、封4图1。

表1 两组大鼠各项指标测定结果比较（±s）

表1 两组大鼠各项指标测定结果比较（±s）

*：P＜0.05,**：P＜0.01与假手术组比较。

组别 n 胰腺组织病理评分（分）NOS阳性神经元的表达（%）胃排空率（%）假手术组10 1.7±0.7 17.03±4.15 71.58±3.89模型组 9 15.6±1.2* 25.19±2.84* 31.33±6.30**

2.5 大鼠胃窦肌间神经丛标本染色情况 荧光显微镜观察大鼠胃窦肌间神经丛主要由神经元和神经纤维构成。全层标本经anti-HuC/HuD染色后观察,神经元胞体形态多样,呈卵圆形、三角形及不规则形,大小不一；胞质、胞核均染为绿色,神经纤维不着色。标本经NOS1（R-20）染色后观察,神经元胞体大小不等,形态多样；胞质呈红色,胞核不着色,神经纤维着色呈网格状分布。NOS阳性神经元所占比例明显增加。与胃窦肌间神经丛相比,回肠神经元细胞较小,多呈条索样分布,神经纤维多呈“井”字分布,而结肠处于两者之间,见封4图2。

3 讨论

SAP是临床上消化系统疾病常见的急危重症之一。胃肠运动障碍是SAP的重要表现。ENS是控制胃肠运动的一个独立的整合系统。NOS神经元是来自ENS的主要抑制性神经元,分泌的一氧化氮（NO）具有重要的松弛胃肠道平滑肌作用。NOS是NO合成的限速酶。NOS抑制剂可清除压力诱导的胃容受性舒张,说明NO能诱导胃舒张,抑制胃的运动[1],有研究表明迷走神经切断后胃电频率及正常电活动百分数较对照组显著下降,提示迷走神经对胃肌电活动的影响可能是由传出纤维介导[2]。神经型一氧化氮合酶（nNOS）被发现沉积在小鼠胃迷走神经传入末梢,NO抑制上皮神经调节作用与选择性作用于迷走神经末梢有关[3]。NO还参与胃慢波的调控[4]。胃动素（motilin,M TL）是胃窦Ⅲ相移行运动复合波（MMC）的启动因素[5],胃壁和十二指肠肌间神经丛中发现有M TL阳性神经元和神经纤维[6]。大部分的MTL受体（68.9%）为nNOS阳性神经元[7],胃窦肌间神经丛多为 nNOS阳性神经元[8],相关实验也证实SAP大鼠结肠的NOS阳性神经元细胞增多[9]。但SAP胰腺组织以结构型一氧化氮合酶（cNOS）和诱导型一氧化氮合酶（iNOS）升高为主[10]。已有研究发现SAP患者血清NO水平升高[11],而血清中的NO部分来源于ENS,本研究结果证实SAP大鼠胃窦nNOS阳性神经元增多,推测胃窦肌间神经丛NOS阳性神经元参与了ENS的重塑。但SAP胃运动障碍受多因素影响,其机制仍不完全清楚。

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