针刺对高脂大鼠主动脉脂联素受体1和2蛋白表达的影响*

袁爱红，蔡 辉

（南京军区南京总医院中西医结合科，南京 210002）

脂联素（APN）是脂肪组织来源的脂肪因子，在人和小鼠的血浆中以不同的低聚物形式存在。临床研究[1]提示，低APN在2型糖尿病、冠状动脉疾病和高血压中的发病机制，实验研究[2]也提示APN在胰岛素抵抗、高血压和心血管疾病的发展中发挥保护作用。APN与脂联素受体（AdipoR）结合后激发各种下游信号，发挥生理作用。高脂饮食诱导的高脂血症大鼠会出现主动脉内皮的损伤及功能的紊乱[3]。为了探讨高脂饮食对机体主动脉APN信号的影响以及针刺对其的作用，笔者用酶联免疫吸附实验（ELISA）法检测血清APN，用Western Blotting法检测主动脉AdipoR1/2含量，现报道如下。

1 材料和方法

实验动物为刚断乳的SD雄性大鼠26只，体质量（60±9）g，由南京军区南京总医院动物实验中心提供，实验动物使用许可证号SYXK（苏）2003-0032。

1.1 实验方法 所有SD大鼠均适应性喂养1周，根据体质量编号，采用随机数字表法随机分为高脂饲料组（17只）和普通饲料组（简称对照组，9只），喂养12周后，空腹过夜，球后静脉取血3 mL，室温静置1h后，3000r/min离心5min，分离血清置-20℃冰箱保存，测血脂4项、一氧化氮（NO）和髓过氧化物酶（MPO）。然后根据体质量编号，采用随机数字表法将高脂饲料组大鼠随机分为模型组（8只）和针刺组（9只），干预4周。

针刺组：选取后三里、内庭、心俞三穴，进针后，每穴快速行针1 min，后三里和内庭接通G6805Ⅱ型电针仪连续波15 min，强度1 mA，频率10 Hz。每次选取一侧肢体，两侧轮流，周一到周六治疗，周日休息，连续4周。实验期间所有大鼠均自由摄食饮水。

1.2 观察指标和方法 实验结束后，禁食24 h，于次日上午8时，用20%氯胺酮，以10 mL/kg剂量麻醉后，剪开胸腹腔，暴露心脏，心脏取血3 mL，血液处理同上。每组随机选取3只，于冰盘中分离主动脉，置液氮中保存待测AdipoR1/2蛋白。甘油三酯（TG）用脂蛋白酶-甘油磷酸氧化酶-过氧化物醇-4-氨基比林和酚法（TPO-PAP），总胆固醇（TC）用胆固醇氧化酶-过氧化物酶-4-氨基比林和酚法（CHOD-PAP），高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）和低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）用选择性沉淀法，NO用硝酸还原法，MPO用邻连茴香胺法，APN用ELISA法（美国R＆D公司），主动脉AdipoR1和AdipoR2蛋白检测用Western Blotting法（Santa Cruz公司），用CD31显示血管内皮细胞，光镜观察主动脉血管的形态学变化。

1.3 统计学方法 干预前高脂与对照比较用独立样本t检验，多组资料组间比较用单因素方差分析，方差齐性用LSD，方差不齐用Games-Howell。统计软件用 SPSS 15.0，统计变量以均数±标准差（±s）表示。

2 结果

2.1 高脂饮食对SD大鼠血脂、NO和MPO的影响

见表1。高脂组大鼠TG和TC明显高于对照组，HDL-C和LDL-C高于对照但无统计学差异。高脂大鼠MPO明显高于对照组，NO明显低于对照组。

表1 干预前高脂和对照组血脂、NO和MPO水平（±s）Tab.1 The serum levels of blood fat,NO and MPO in hyperlipaemia and control group before treatment（±s）

表1 干预前高脂和对照组血脂、NO和MPO水平（±s）Tab.1 The serum levels of blood fat,NO and MPO in hyperlipaemia and control group before treatment（±s）

注：与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01。

组别对照组高脂组n917 TG(mmol/L)0.93±0.151.82±0.36*HDL-C(mmol/L)1.06±0.171.61±0.82组别对照组高脂组n917 LDL-C(mmol/L)0.20±0.050.41±0.38 TC(mmol/L)1.83±0.233.39±0.93**NO(μmol/L)23.08±3.4213.07±3.14**MPO(U/L)42.28±7.6552.23±6.45**

2.2 针刺对高脂大鼠APN和AdipoR蛋白的影响见表2、图1。模型组血清APN明显低于对照组，针刺组明显高于模型组。模型组主动脉AdipoR1蛋白明显低于对照组，针刺组高于模型组低于对照组；模型组主动脉AdipoR2蛋白明显低于对照组，针刺组高于模型组，低于对照组。

表2 干预后各组APN、AdipoR表达情况（±s）Tab.2 The serum APN and protein contents of AdipoR of each group after treatment（±s）

表2 干预后各组APN、AdipoR表达情况（±s）Tab.2 The serum APN and protein contents of AdipoR of each group after treatment（±s）

注：与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较，▲P<0.05，▲▲P<0.01。

组别对照组模型组针刺组APN（g/L）97.3218±3.1684▲▲77.7054±9.5204**100.3864±3.4116▲▲AdipoR1蛋白0.5006±0.0622▲▲0.0746±0.0258**0.2839±0.2269 AdipoR2蛋白0.5908±0.0677▲▲0.1778±0.0384**0.3588±0.0543*▲

2.3 针刺对高脂大鼠主动脉形态学的影响 光镜显示：模型组大鼠内皮组织大部脱落，平滑肌明显增生，排列紊乱，细胞肥大；针刺组内皮基本完好，偶有脱落，平滑肌细胞增殖不明显，排列规则；对照组大鼠内皮光滑平整，平滑肌组织分布均匀。见图2-4。

3 讨论

脂联素也称作ACRP30和AdipoQ，在人和小鼠的血浆中以三聚体、六聚体和高分子量形式存在[4]。脂肪组织能够正性调节许多脂肪细胞因子，但是体脂含量，特别是内脏脂肪负性调节血浆中脂联素的水平。脂联素对血管生成和内皮功能产生有力的影响。研究显示[5]，脂联素能够减少载脂蛋白E（ApoE）缺乏小鼠的动脉粥样硬化，刺激内皮细胞迁移和分化为毛细管样结构，阻止内皮细胞凋亡；腺病毒介导脂联素的传递增加了野生鼠和脂联素基因剔除小鼠内皮祖细胞的动员，用脂联素孵育人周围血单核细胞增加了内皮祖细胞数量；脂联素堆积在受伤动脉的内皮和内皮下膜，抑制内皮炎症反应和平滑肌细胞增殖。氧化应激等会造成脂联素的减少，脂联素减少又会加剧氧化应激状态。主动脉内皮细胞表达AdipoR1和AdipoR2，优先表达AdipoR1。研究发现[6]，AdipoR1和AdipoR2在同组织同影响条件下表达有不同。疾病过程中AdipoR含量上调或下调及其活化状态改变均可以引起细胞对APN的敏感性变化，从而影响细胞的代谢及功能，成为促进疾病发生与发展的重要机制之一。

本实验显示，高脂饮食造成的高脂血症大鼠血清MPO明显升高、NO明显降低，脂联素水平显著降低，主动脉脂联素受体1和2显著减少，分析认为，进食大量高脂饮食后，体内脂质过氧化增多，产生了过多的氧自由基，造成机体氧化应激增加，损伤了脂联素信号的传递，降低了脂联素对血管的保护作用，主动脉出现损伤；主动脉损伤后产生多种炎症因子，进一步影响脂联素信号的传递，使机体氧化应激和炎症反应加剧，造成恶性循环。本实验中，针刺组大鼠血清MPO明显下降，NO和脂联素水平明显上升，主动脉脂联素受体2明显增加，脂联素受体1有上升趋势，说明针刺能够增加高脂饮食机体主动脉脂联素信号的表达，发挥对主动脉的保护作用。根据本实验结果，笔者认为针刺上调脂联素信号包括了对脂联素和脂联素受体两方面的调节，针刺对主动脉脂联素信号的调节中脂联素受体2发挥了主要介导作用。最近，Hug等[7]分离了第三种表达在血管内皮和平滑肌的脂联素受体T-cadherin，其是否在针刺对血管的保护中发挥作用有待进一步研究。

本研究显示，喂高脂饮食12周后，高脂饮食组大鼠HDL-C升高，与文献记载相符，这可能与饮食中的脂肪刺激肌肉脂蛋白酯酶活性，增加转运率，减少HDL-C的主要转运蛋白载脂蛋白A1（ApoA1）的分解率，饱和脂肪酸的高摄入可能增加了HDL-C。

[1] Otsuka F,Sugiyama S,Kojima S,et al.Hypoadiponectinemia is associated with impaired glucose tolerance and coronary artery disease in non-diabetic men.Circ J ，2007，71(11):1703-1709.

[2] Takemura Y,Ouchi N,Shibata R,et al.Adiponectin modulates inflammatory reactions via calreticulin receptor-dependent clearance of early apoptotic bodies[J].J Clin Invest， 2007，117(2):375-386.

[3] 吴 峻,孙 明,林锦潮,等.非诺贝特对高脂血症大鼠NO及血管内皮细胞粘附分子-1表达的影响[J].南方医科大学学报,2007;27(12):1872-1874.

[4] Pajvani UB,Du X,Combs TP,et al.Structure-function studies of the adipocyte-secreted hormone Acrp30/adiponectin.Implications fpr metabolic regulation and bioactivity[J].J Biol Chem，2003，278(11):9073-9085.

[5] Ouchi N,Kobayashi H,Kihara S,et al.Adiponectin stimulates angiogenesis by promoting cross-talk between AMP-activated protein kinase and Akt signaling in endothelial cells[J].J Biol Chem，2004，279(2):1304-1309.

[6] Saito Y,Fujioka D,Kawabata K,et al.Statin reverses reduction of adiponectin receptor expression in infarcted heart and in TNF-alphatreated cardiomyocytes in association with improved glucose uptake[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol，2007，293(6):3490-3497.

[7] Hug C,Wang J,Ahmad NS,et al.T-cadherin is a receptor for hexameric and high-molecular-weight forms of Acrp30/adiponectin[J].Proc Natl Acad Sci U S A ，2004，101(28):10308-10313.