丝裂霉素C对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖的影响

孙 奎 吴晓明 孙艳军 张宏霞 王鹤鹏 杨景哲

(承德医学院附属医院烧伤整形外科，河北 承德 067000)

丝裂霉素C对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖的影响

孙 奎 吴晓明 孙艳军 张宏霞 王鹤鹏 杨景哲

(承德医学院附属医院烧伤整形外科，河北 承德 067000)

目的 探讨丝裂霉素C(MMC)对瘢痕疙瘩成纤维细胞(KFB)增殖的影响。方法 采用不同浓度的MMC作用于体外培养的FB，采用四唑盐比色(MTT)方法，观察MMC对体外培养的KFB增殖活性的影响。采用RT-PCR方法，检测MMC对体外培养的KFB TGF-β1mRNA表达的影响。结果 MTT显示在24、48、72 h时间段内，随着培养时间的增加，细胞生长抑制率呈现上升趋势，作用48 h、72 hKFB与24 h相比KFB有极显著差异(P＜0.01)，作用72 h与48 h相比，有上升趋势，但差异比不显著，24 h为最佳作用时间。RT-PCR方法显示:MMC干预组TGF-β1mRNA相对表达量明显低于正常对照组，从12.5 μg/mlMMC开始具有显著的统计学差异(P＜0.01)，随MMC浓度增大，MMC干预组TGF-β1mRNA相对表达量呈逐渐降低趋势。结论 2.5～200 μg/ml范围的MMC可有效抑制体外培养的病理性KFB的增殖活性，当浓度为200 μg/ml时作用尤为明显，MMC对TGF-β1mRNA的表达具有明显减弱效应。

瘢痕疙瘩;成纤维细胞;丝裂霉素C;增殖;转化生长因子β

瘢痕疙瘩是皮肤损伤后组织异常修复的结果，瘢痕疙瘩成纤维细胞(KFB)过度增殖及成纤维细胞过量合成胶原等细胞外基质(ECM)为其特征。瘢痕疙瘩是当今整形外科领域的研究热点和难点〔1〕。本文拟观察丝裂霉素C(MMC)对KFB增殖的影响因素。

1 材料与方法

1.1 标本来源 标本分别取自承德医学院附属医院整形科13例因瘢痕疙瘩入院进行整形手术的患者:男9例、女4例，年龄55～64〔平均(59.6±3.4)〕岁。取材部位上肢5例。面部3例，躯干5例。选取病程短且生长活跃的瘢痕疙瘩组织，未接受任何抑制瘢痕增生的治疗，均无系统性疾病史，且患者对所取组织用于实验均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 KFB培养和实验分组 将手术切下的瘢痕疙瘩组织均采用组织块贴壁培养法进行体外培养。在无菌条件下切除表皮及皮下脂肪，将标本制成1 mm3左右的组织块，置于培养瓶中，在95%空气、5%CO2、37℃、饱和湿度条件下培养8～12 h。然后加入含15%胎牛血清的DMEM培养液适量，继续培养，3～4 d换液1次，2～3 w后，原代细胞生长成单层，用0.25%胰蛋白酶消化后，按1∶3的比例传代培养。常规培养KFB24 h后，吸去培养液和未贴壁细胞，更换含不同药物浓度的培养液，实验分为正常对照组、MMC干预组，正常对照组用DMEM培养液;MMC干预组 MMC 的终浓度分别为 2.5、12.5、50、100、200 μg/ml。

1.2.2 MTT法测定KFB的增殖 取对数生长期的KFB，用2.5 g/L胰酶消化，调整细胞密度至2×104/ml，接种于3块96孔培养板，每孔100 μl。常规培养24 h后，吸去培养液和未贴壁细胞，根据分组不同更换含不同药物浓度的培养液，每孔加入各组溶液200 μl，每浓度复种8孔。标准环境下分别孵育24、48、72 h 后，向每孔内加入 20 μl MTT(5 mg/ml)溶液，继续培养4 h。倒置显微镜下观察MTT结晶状况，然后弃去孔内上清液，每孔内加入150 μl二甲基亚砜，摇床振荡10 min后，在酶标仪下测定波长490 nm处的光密度值，设8个复孔，计算药物作用于KFB的生长抑制率。抑制率=1－(药物干预组A490值/空白对照组A490值)×100%，最后以时间为X轴，抑制率为Y轴绘制生长曲线，并获得最佳培养时间。

1.2.3 检测转化生长因子-β1(TGF-β1)mRNA水平 将KFB按10 cm2/ml比例加入Trizol，用Trizol总RNA提取试剂盒提取细胞总RNA，经紫外分光光度计(日本导津UV2201型)测定总RNA浓度和纯度，重复测定3次，A260和A280之比应在1.8～2.0，计算样品总RNA浓度。引物序列为:TGF-β1cDNA扩增的上游引物为5'-ctg ctt cag ctc cac aga gaa ga-3'，下游引物为5'-aag ttg gcg tgg tag ccc tt-3'，产物片段长度为111 bp。取1 μg总 RNA，加入 Oligo(dT)18 Primer，70℃温育 5 min;迅速放入冰浴中，加入10 mmol/L dNTP、RNA酶抑制剂、5×缓冲液，42℃温育5 min;冰浴中加入5 U/μl苜蓿花叶病病毒(AMV)逆转录酶，加入焦碳酸二乙酯(DEPC)处理水至总体积20 μl，42℃温育60 min，70℃ 10 min，置冰上，－80℃冰箱保存备用。将反应管置于PCR仪上，95℃预变性10 min后，95℃变性1 min，50℃退火30 s，共34次，最后72℃充分延伸10 min。反应完成后取10 μl PCR反应液，经1%琼脂糖凝胶电泳，用PCR Marker作分子量标准。电泳完毕后在紫外荧光数字成像仪下观察结果。以每例TGF-β1与β-actin扩增产物条带光密度的比值作为TGF-β1mRNA的相对表达量。

1.3 统计学方法 应用SPSS11.5统计软件进行分析，所有数据资料以±s表示，进行方差分析，两两比较用LSD-t检验。

2 结果

2.1 体外KFB的形态学观察 体外KFB原代培养成功后，培养细胞呈梭形，细胞体积较大，胞质向外伸出2～3个长短不同的伪足，有一个较大的卵原形核，细胞界限清楚。开始单个细胞一般铺展很开，细胞间排列疏松，有较大的细胞间隙;随后细胞增多，细胞相互平行排列，成群细胞呈漩涡状或放射形。见图1。

2.2 MMC对KFB增殖活性的影响 2.5 μg/ml的MMC即对细胞生长有明显的抑制作用，这种抑制作用在200 μg/ml时达到最大，显示出明显的剂量-效应依赖关系。随着培养时间的增加，细胞生长抑制率呈现上升趋势，作用48、72 h与24 h相比有极显著差异(P＜0.01)，作用72 h与48 h相比有上升趋势，但差异不显著;24 h为最佳作用时间，所用细胞在最大剂量和最长时间药物作用后均无坏死。见图2。

图1 体外KFB形态学观察(×200)

图2 MMC对KFB增殖活性的影响

图3 各组TGF-β1mRNA PCR产物琼脂糖凝胶电泳图

2.3 不同浓度的MMC对TGF-β1mRNA表达的影响 RNA提取后，经Bio-mini测定，A260/A280均为1.8～2.0。琼脂糖凝胶电泳显示所提RNA完整，降解较少，表明RNA提取成功。总RNA扩增产物电泳后背景清晰，未见电泳条带，表明无基因组DNA污染。TGF-β1mRNA RT-PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳为110 bp的条带，结果与预期一致，证明所扩增产物为目的片段。见图3。正常对照组及 2.5、12.5、50、100、200 μg/ml MMC干预组的 TGF-β1mRNA相对表达量分别为0.88±0.07，0.80±0.06，0.51 ±0.04，0.47 ±0.05，0.36 ±0.03和0.22±0.02。MMC干预组TGF-β1mRNA相对表达量明显低于正常对照组，从12.5 μg/ml MMC开始具有显著差异(P＜0.01);随MMC浓度增大，MMC干预组TGF-β1mRNA相对表达量呈逐渐降低趋势。

3 讨论

瘢痕疙瘩是皮肤损伤后伤口愈合过程中出现KFB过度增殖、胶原大量沉积，也是皮肤损伤后组织异常修复的结果。目前对瘢痕发生的机制仍知之甚少。目前临床多采用局部药物注射、压迫治疗、手术和激光治疗等综合治疗，效果不明显。

研究表明，MMC对KFB增殖有抑制作用，可能是通过调控CyclinD1/CDK4/P27通路中各因子表达平衡、使细胞周期停滞于G1/S期而实现〔2〕。MMC的主要作用是对于KFB增殖具有较强抑制作用，是氟尿嘧啶的100倍，并有时间依从性，作用时间可达到无限期抑制增生;同时与剂量密切相关，大剂量时可以成为不可逆性抑制〔3〕。有研究表明，手术切除瘢痕疙瘩后，局部使用MMC取得了满意的临床效果〔4〕。于冬梅等〔5〕实验结果表明，MMC对体外培养KFB增殖的抑制作用与药物浓度、处理时间有关，同时发现低剂量MMC对KFB的作用是通过下调Cyclin D1抑制细胞增殖和激活caspase-3诱导细胞凋亡而实现的。应用MMC处理KFB，能抑制KFB的增殖;在每一时间段，随着浓度的增加，细胞生长抑制率呈现明显的上升趋势，显示明显的剂量-效应依赖关系〔3〕。刘莺等〔6〕证实 100 μg/ml MMC对KFB细胞的增殖抑制效果最佳，为该药物临床应用提供了有力的实验依据。

本实验中MTT结果显示，MMC对KFB的增殖活性有明显抑制作用，这种作用随药物浓度、时间的升高明显增强，200 μg/ml MMC对KFB的增殖抑制作用最佳。

TGF-β1是目前公认的与瘢痕疙瘩形成最为密切的细胞因子〔7〕。TGF-β家族成员包含许多结构上的多肽段生长因子，对表皮细胞的生长、分化、凋亡及肿瘤形成具有调控作用〔8〕。其受体是普遍存在于正常细胞及肿瘤细胞表面上的一种跨膜糖蛋白，具有高度的特异性和亲和力。TGF-β1可直接刺激血管生成，刺激Fb增殖及细胞中葡萄糖与氨基酸的转运和糖酵解的进行〔9〕，导致 Fb合成胶原〔10〕、纤维连接蛋白和层黏连蛋白增加，同时也抑制基质金属蛋白酶(MMPs)活性和促进MMPS组织抑制剂(TIMPs)与纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1)基因的表达，进而抑制ECM的降解;还介导血小板源性生长因子、结缔组织生长因子的致纤维化作〔11〕;增加细胞与ECM的相互作用，促进纤维黏连蛋白和胶原基质的黏附，促进瘢痕的形成。陈伟等〔12〕研究发现，TGF-β1的存在会不断刺激KFB诱导基质产生，导致ECM的过度沉积。曹艳杰等〔13〕研究发现丹参涂膜剂可改善增生期瘢痕微循环局部缺氧状态，抑制成熟过渡期瘢痕微循环血供，也可显著降低TGF-β1在肥厚性瘢痕中的光密度值，而丹参活血化瘀中药可抑制瘢痕组织内细胞因子TGF-β1的表达。

本实验结果显示，MMC干预组较对照组TGF-β1mRNA降低;随作用时间增加，TGF-β1mRNA表达变化越为明显，在处理72 h后，TGF-β1mRNA表达变化最明显，且在药物浓度为200 μg/ml时 TGF-β1mRNA 表达量减弱最明显。提示 TGF-β1有助于瘢痕疙瘩的形成，MMC可能通过减少TGF-β1表达，从而起到抑制瘢痕增生的作用。

1 Kelly AP.Medical and surgical therapies for keloids〔J〕.Dermatol Ther，2004;17(2):212-8.

2 Fujiwara M.Keloid derived fibroblasts show increased secretion of factors involved in collagen turnover and depended on matrix metalloproteinase for migration〔J〕.Br J Dermatol，2005;153(2):295-300.

3 陈诗书，汤雪明.医学细胞与分子生物学〔M〕.北京:科学出版社，2004:717-22.

4 Stewart CE，Kim JY.Application of mitomycin-C for head and neck keloids〔J〕.Otolaryngol Head Neck Surg，2006;135(6):946-50.

5 于冬梅，郝立君，李 颖，等.丝裂霉素C对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖及凋亡的影响〔J〕.中国临床药理学与治疗学，2007;12(8):900-5.

6 刘 莺，于冬梅，郝立君，等.丝裂霉素C对瘢痕疙瘩成纤维细胞Cyclin D1、CD K4及P27基因表达的影响〔J〕.中国组织化学与细胞化学杂志，2008;17(2):126-31.

7 Liu W，Wang DR，Cao YL.TGF-β:a fibrotic factor in wound scarring and a potential target for anti-scarring gene therapy〔J〕.Curr Gene Ther，2004;4(1):123-36.

8 Lopez-Casiilas F，Payne HM，Andres JL，et al.Betaglycan can act as a dual modulator of TGF-β access to signaling receptors:mapping of ligand binding and GAG attachment sites〔J〕.J Cell Biol，1994;124(4):557-68.

9 Memullen H，Longaker MT，Cabrera RC，et al.Spatial and temporal expression of transforming growth factor-β isoforms during ovine excisional and incisional wound repair〔J〕.Wound Repair Regen，1995;3(2):141-56.

10 Zhang K，Gamer W，Cohen L，et al.Increased typeⅠ and Ⅲ collagen and transforming growth factor-beta1 mRNA and protein in hypertropic bum scar〔J〕.J Invest Dermatol，1995;104(5):750-4.

11 Murata H，Zhou L，Ochoa S，et al.TGF-beta3 stimulates and regulates collagen synthesisthrough TGF-beta1-dependentand independent mechanisms〔J〕.J Invest Dermat，1997;108(3):258-62.

12 陈 伟，付小兵，葛世丽，等.增生性瘢痕形成和成熟过程中TGF-β1、TGF-β3及其受体的基因表达变化〔J〕.中华整形外科杂志，2004;20(4):308-9.

13 曹艳杰，王福波.丹参涂膜剂对肥厚性瘢痕裸鼠模型血液流变学及细胞因子TGF-β1、bFGF的影响〔J〕.细胞与分子免疫学杂志，2010;26(6):580-2.

〔2012-01-10收稿 2012-01-20修回〕

(编辑 袁左鸣)

The effect of mitomycin C on proliferation of keloid fibroblasts

SUN Kui，WU Xiao-Ming，SUN Yan-Jun，et al.
The Affiliated Hospital of Chengde Medical College，Chengde 067000，Hebei，China

Objective To study the effect of mitomycin C(MMC)on cell proliferation of keloid fibroblasts(KFBs).Methods The different concentration of MMC was used to KFB，the activity of KFB and TGF-β1 mRNA expression were tested.Results At 24，48，72 h，the growth inhibition rate was increased，TGF-β1 mRNA expression was gradually decreased with the MMC concentration increased.Conclusions MMC could attenuate the expression of TGF-β1 mRNA.

Keloid;Fibroblast;Mitomycin C;Proliferation;Transforming growth factor-β

R34

A

1005-9202(2012)17-3723-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.17.050

孙 奎(1971-)，男，副主任医师，主要从事烧伤整形外科学的研究。