水产品中甲醛HPLC测定的前处理方法探讨

董靓靓，朱军莉，励建荣

(浙江工商大学食品与生物工程学院，浙江省食品安全重点实验室，浙江杭州 310035)

水产品中甲醛HPLC测定的前处理方法探讨

董靓靓，朱军莉*，励建荣*

(浙江工商大学食品与生物工程学院，浙江省食品安全重点实验室，浙江杭州 310035)

为了探讨前处理方法对水产品甲醛检测的影响，本文比较了三氯乙酸结合超声提取法(超声+TCA法)、三氯乙酸提取法(TCA法)、蒸馏水提取法、水蒸气蒸馏法四种前处理方法的高效液相色谱法(HPLC)测定甲醛。结果显示，水蒸气蒸馏和三氯乙酸超声提取平均回收率分别为109.06%和103.62%，而蒸馏水提取的回收率低于40%。经优化后的三氯乙酸超声提取条件优化为超声时间25min，10%TCA加入量10mL。因此，三氯乙酸超声提取具有稳定性较好，操作简便，与水蒸气蒸馏法前处理效果相当，是一种适合用于大多数鲜活和冷冻水产品甲醛含量检测的前处理方法。

前处理，甲醛，HPLC

甲醛是一种毒性很强的破坏生物细胞蛋白质的原生物质，对人的神经系统、肺、肝脏均可产生损伤。甲醛已经被世界卫生组织确定为致癌和致畸物质，也是潜在的强致突变物之一［1］。因此，我国已禁止其作为添加剂加入到食品中［2］。但近年来大量调查研究发现，水产品中高含量的甲醛并非人为添加或者环境污染所致，而是在贮藏和加工过程中在内源性酶等［3－9］催化下自然产生，如在冷冻和冰冻贮存过程中，鱼肉中氧化三甲胺在氧化三甲胺酶的作用下分解为二甲胺和甲醛。检测食品中甲醛时，样品前处理方法影响样品中甲醛的检测值。首先，处理过程可能导致食品中内源性甲醛的产生。如水产品中存在氧化三甲胺的分解、蛋白质和脂肪的分解和氧化等，高温蒸煮等过程会导致鱿鱼中甲醛含量的增加。研究发现，鱿鱼制品高含量的甲醛主要来源于加工中的热处理工序，并且鱿鱼制品低温贮存可以减少甲醛的生成［10］。且靳肖等人［11］通过建立鱿鱼丝氧化三甲胺热分解模拟体系证实了加热时间、加热温度和pH对氧化三甲胺热分解有一定的影响。其次，不同前处理方法提取的甲醛形态不同。海产品中甲醛主要以3种方式存在［12］:一是自由型甲醛;二是可逆结合型甲醛;三是为不可逆结合型甲醛。海产品中甲醛对鱼肉的影响不同，自由型甲醛对食品的毒性发生具有重要影响，结合型甲醛与冻鱼组织蛋白结合，是导致鱼在冰冻贮藏期间质量下降的原因［13］。因此，不同的前处理方法会影响海产品中甲醛的检测结果，目前食品中甲醛前处理方法主要有水蒸气蒸馏法［14］和蒸馏水提取法［15］。水蒸气蒸馏法能提取游离甲醛和可逆结合态甲醛，但不能避免食品中成分转变分解或衍生形成内源性甲醛［16］。蒸馏水提取法能提取食品中游离甲醛，但不能提取结合态甲醛。且样品中富含蛋白质时，易形成可逆结合态的蛋白质－甲醛复合物，蒸馏水提取法提取时甲醛的添加回收率不佳。建立灵敏度高，抗干扰强的甲醛检测技术是科学和准确的评价水产品中甲醛问题的前提。目前，测定甲醛的方法主要有分光光度法、气相色谱法和高效液相色谱法。分光光度法检测水产品和食品中的甲醛，原理简单，操作简便，呈色稳定，但相对于色谱法来说，灵敏度低，抗干扰性差，而色谱方法抗干扰性强，具有灵敏性高、重复性好、精确度高等优点。郑斌等人［17］采用三氯乙酸提取水产品中的游离态甲醛，经2，4－二硝基苯肼衍生化后，利用HPLC测定水产品中游离甲醛含量。为了探讨不同样品前处理对水产品中甲醛含量的影响，本文以甲醛本底含量较高的鳕鱼、龙头鱼、鱿鱼为代表性海产品，系统的比较了三氯乙酸结合超声提取法、三氯乙酸(TCA)溶液提取法、蒸馏水提取法、水蒸气蒸馏法前处理方法，并采用准确、高效、抗干扰性强的高效液相色谱法［18］测定，旨在找到一种操作简便、重复性好和回收率高的样品前处理方法，为HPLC测定水产品中甲醛含量提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

2，4－二硝基苯肼、磷酸、NaOH 分析纯，上海化学试剂公司;三氯乙酸(TCA) 分析纯，杭州汇普化工仪器有限公司;Tris(base) 杭州昊鑫生物科技有限公司;甲醛标准溶液 100mg/L，国家环保总局;甲醇、乙腈 色谱纯，TEDIA公司;实验所用的水 均为超纯水;秘鲁鱿鱼(冷冻) 舟山兴业公司;鳕鱼(冷冻)、龙头鱼(冰鲜)和甲醛调查中的水产品及其制品 分别购买于杭州水产品批发市场、杭州市物美、乐购等大超市。

安捷伦1100高效液相色谱仪(配有紫外检测器和Rev.A.06.03色谱工作站)、Agilent ODS2－C18柱(4.6mm×200mm，5μm) 美国安捷伦公司;高速冷冻离心机 德国Sigma公司;K－100型超声仪 昆山市超声仪器有限公司;DKS－12型电热恒温水浴锅上海经济区海盐中新电器厂;W II－866型旋涡混合器太仓市科教器材厂。

1.2 实验方法

1.2.1 样品前处理

1.2.1.1 超声+TCA法 称取5.00g试样至100m L具塞三角瓶中，加入40m L超纯水，置于100W超声仪中冰浴超声25min，加10m L 10%TCA。取出后在10000 r/m in条件下离心 5min，取滤液用 1mol/L NaOH调pH至3左右，定容至50m L备用。

1.2.1.2 TCA法［17］称取5.00g试样至100m L具塞三角瓶中，加入40m L超纯水，于室温下静置30m in，加入10m L 10%TCA。取出后在10000 r/m in条件下离心5m in，取滤液用1mol/L NaOH调pH至3左右，定容至50m L备用。

1.2.1.3 蒸馏水法［15］称取5.00g试样至100m L具塞三角瓶中，加入50m L超纯水，旋紧塞子后漩涡振荡1m in，于室温下静置30m in。取出后在10000 r/m in条件下离心5m in，取出滤液，定容至50m L备用。

1.2.1.4 水蒸气蒸馏法［14］称取10.00g试样于蒸馏瓶中，加入20m L蒸馏水、适量沸石，用玻璃棒搅拌混匀。加入10m L体积浓度为10%磷酸溶液，立即通入水蒸气蒸馏。接收管下口事先插入盛有10m L蒸馏水且置于冰浴的蒸馏液接收装置中，收集蒸馏液至200m L。蒸馏液待用。

FPGA芯片的可重构资源分区数量与位置信息固定，待布局逻辑功能个数、所需资源数量与种类等信息在布局前也已确定，并且在布局过程中不会发生变化，所以在UPRFloor布局策略中使用常量表示上述信息，具体定义如表1所示.

1.2.2 衍生和液相检测 取制备好的提取液1m L于10m L具塞比色管中，加入 0.5m L的 1mg/m L的DNPH衍生剂后在60℃下加热 40m in，冷却后过0.45μm滤膜，取20μL进液相。

1.2.3 色谱条件 色谱柱:ODS－C18柱;流速: 1.0m L/m in;流动相:甲醇∶水=70∶30;检测器:紫外检测器;波长:355nm。

1.2.4 澄清度测定 采用分光光度法，以蒸馏水作参比，用1cm比色皿，在410nm波长下测定透光率，用透光率(T%)表示上清液的澄清度［19］。

1.2.5 数据处理 实验重复3次，结果以均值±标准偏差表达(Mean±SD)。用Microsoft Excel和Origin 7.5进行数据处理和作图，并用 SPSS进行统计学分析。

2 结果与分析

2.1 样品前处理方法的选择

本实验选择超声+TCA提取、TCA提取、蒸馏水提取以及水蒸气蒸馏四种方法分析秘鲁鱿鱼(冷冻)、鳕鱼(冷冻)和龙头鱼(冰鲜)样品。从图1结果显示，秘鲁鱿鱼和龙头鱼经超声+TCA提取、TCA提取、蒸馏水提取和水蒸气蒸馏的含量分别为9.538，9.321，8.012，9.686mg/kg和 43.314，40.107，37.206，42.924mg/kg，而鳕鱼经四种前处理的含量为51.352，48.216，42.271和52.671mg/kg。可见，蒸馏水提取方法前处理的样品甲醛检出量低于其他前处理提取的样品，表明该方法不能有效提取海产品中实际甲醛含量。而水蒸气提取方法测得的样品甲醛含量存在较大的标准偏差，这可能是由于水蒸气蒸馏法存在较大稀释倍数使提取液中的甲醛含量过低，造成较大误差。

图1 三种海产品甲醛检测的不同前处理方法Fig.1 Different pre－treatmentmethods of formaldehyde determining in three kinds of seafood

由于海产品提取过程中水溶性蛋白的不断溶出，加上超声的强化作用，使得提取液较为浑浊，很难通过过滤离心等方式获得清液，因此需要选择适当的试剂以除去杂质和蛋白质。而TCA作为一种强酸，能很好地沉淀蛋白质。用TCA沉淀蛋白后离心，可以获得澄清的溶液。因此选择10%TCA作为蛋白质沉淀剂，并加入超声强化提取，以提高甲醛提取量。该处理方法操作简便、准确性高，稳定性好，适合于海产品中甲醛的检测。

本实验以秘鲁鱿鱼(冷冻)为实验材料，加标后进行不同前处理后测定甲醛含量，不同前处理对鱿鱼甲醛加标回收率见表1。结果表明，水蒸气蒸馏对鱿鱼样品的回收率达到109.06%，虽然回收率较高，但平行性不高且操作繁杂。此外，对于本底含量较低的水产品，蒸馏液稀释倍数相对较大会对测定结果造成一定误差。蒸馏水提取法采用直接水提，不论是样品中甲醛含量还是加标回收率都明显偏低，因其提取过程中水溶性蛋白的溶出使得提取液较浑浊，不利于高效液相测定。因此，在水提的基础上加入10%TCA作为蛋白质沉淀剂，并加入超声强化提取，以提高甲醛提取量。结果表明，TCA结合超声的方法回收率为103.62%，能够达到水蒸气蒸馏法测定甲醛含量的效果，且稳定性较好，操作简便。因此，可以选TCA结合超声法作为甲醛检测的前处理。

表1 鱿鱼样品四种前处理加标回收率Table 1 Different pre－treatmentmethods of formaldehyde recovery in squid

2.3 超声三氯乙酸提取方法的优化

2.3.1 超声时间的不同对甲醛提取量的影响 本实验以秘鲁鱿鱼(冷冻)为实验材料，考察超声时间的不同对提取样品中甲醛提取量的影响，其中样品提取时蒸馏水和TCA添加量保持不变。由图2可知，超声时间的延长有利于样品中甲醛的提取，这是因为超声波的振动能产生强烈的空化及搅拌作用，加速有效成分溶入溶剂，提高样品中有效成分的得率［20］。而当超声时间到达25m in后，对甲醛的提取几乎无显著影响。因此，超声时间选择25m in较为合适。

2.3.2 TCA加入量对甲醛含量测定的影响 本实验以秘鲁鱿鱼(冷冻)为实验材料，考察TCA加入量的不同对提取样品中甲醛提取量和上清液澄清度的影响，其中样品提取时超声时间和样品总提取体积保持不变。由图3可知，TCA加入量对样品中甲醛提取量影响不大，但因提取过程中水溶性蛋白的不断溶出，TCA加入量对提取液的澄清度有很大影响。这是因为TCA作为一种良好的蛋白质沉淀剂，一经加入会使样品中的蛋白质构象发生改变，暴露出较多的疏水性基团，使之聚集沉淀［21］，一经离心后就能得到较为澄清的上清液。从澄清度和TCA成本考虑，加入10m L的10%TCA较为合适。

图2 超声时间对甲醛提取量的影响Fig.2 Effect of ultra－sonic wave time on the extraction of formaldehyde

图3 TCA加入量对甲醛提取量的影响Fig.3 Effect for extraction of formaldehyde in addition of TCA

2.3.3 pH对甲醛含量测定的影响 考虑到样品的提取液使用的是强酸，pH在1左右，因此本实验考察了pH对甲醛衍生及最终测定值的影响。

图4 pH对甲醛含量测定的影响Fig.4 Effect for determination of formaldehyde in pH

本实验以鱿鱼为实验材料，采用最优超声+TCA提取方法获得上清液。取适量上清液，用缓冲溶液调pH分别至2，3，4，5，6，7，考察不同pH对衍生产物产率(以衍生产物的峰面积来衡量)的影响。由图4可见，pH在2～5范围内，衍生物的产率都表现较高的稳定性，与文献结果一致［22］，pH高于5时，甲醛检测值下降。但考虑到样品提取时采用的是强酸以及C18柱子的寿命，因此样品经超声+TCA前处理后需把pH用缓冲溶液调节至3～5范围间，以提高测定样品甲醛的准确性。

2.4 水产品及其制品中甲醛含量调查结果

以TCA结合超声和水蒸气蒸馏作为样品前处理方法，利用高效液相色谱法检测了常见海产鱼类、甲壳头足类、淡水鱼类和水产制品40种样品，甲醛本底含量见表2。海产鱼类中鳕鱼类和母狗鱼甲醛含量较高，甲醛检出率为100%，其中鳕鱼样品甲醛含量高于49mg/kg;甲壳类和头足类中甲醛含量较低，其含量低于10mg/kg，甲醛检出率为100%，其中鱿鱼中甲醛含量相对较高，而贝类中甲醛含量很低;淡水鱼中均未检测出甲醛;而四类水产制品中均检测出甲醛，其中龙头鱼制品中甲醛含量超过100mg/kg，鱿鱼和鳕鱼制品中甲醛含量也较高，应关注其食用安全。高效液相色谱检测甲醛的两种样品前处理有一定差别，其中对于大多数鲜活和冷冻样品而言，TCA超声提取略大于或与水蒸汽蒸馏处理结果相似，表明了它是一种适合用于大多数鲜活和冷冻水产品甲醛含量检测的前处理方法。水产品甲醛检测结果与柳淑芳等［23］报道的食用鱼甲醛本底含量研究一致，食用鱼类的甲醛本底含量不同且差异较大，水产制品、海产鱼类中不同状态都检测出了甲醛，海产鱼类甲醛含量较高，而淡水鱼类中未检测出甲醛。同时，水产品中甲醛含量与品种和贮藏状态时间有关，研究［24－25］表明海产鱼类中普遍存在较高活性的甲醛生成酶系和高含量的氧化三甲胺，在冻藏过程中该酶可以分解氧化三甲胺生成等比例的甲醛和二甲胺，从而使海产鱼类特别是鳕鱼科等具有高含量的甲醛本底。

表2 水产品及其制品中甲醛含量调查结果Table 2 The amount of formaldehyde in various aquatic products

3 结论

三氯乙酸结合超声提取法(超声+TCA提取法)回收率高，提取相对较完全，能够达到水蒸气蒸馏法测定甲醛含量的效果，且稳定性较好，操作简便。因此，该方法是一种适合用于大多数鲜活和冷冻水产品中甲醛含量检测的前处理方法。

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Study on pre－treatmentmethods for determ ination of formaldehyde in aquatic products by HPLC

DONG Liang－liang，ZHU Jun－li*，LI Jian－rong*
(College of Food Science and Biotechnology，Zhejiang Gongshang University，Hangzhou 310035，China)

In order to investigate the effects of p re－treatmentmethods on determ ination of formaldehyde in food，the experiment，four p re－treatmentmethods，trichloroacetic acid combined w ith ultra－sonic extraction(ultra－sonic+ TCA)，trichloroacetic acid solution extrac tion(TCA)，water extraction and steam d istillation was com pared in determ ination of formaldehyde by high performance liquid chromatography(HPLC).The results showed that the average recovery of steam d istillation and ultra－sonic+TCA method were 109.06%and 103.62%，respec tively，whereas，water extraction was of less than 40%.The op tim ized cond itions of TCA combined w ith ultra－sonic were ultrasonic time of 25m in and 10%TCA add ition value of 10m L.Therefore，TCA comb ined w ith ultra－sonic exhibited sim ilar result in extraction of formaldehyde compared w ith steam distillation.The method w ith sim p le operation，and good stability，could be app lied to determ ine the formaldehyde in fresh and frozen aquatic p roduc ts.

p re－treatment;formaldehyde;HPLC

TS254.7

A

1002－0306(2012)12－0064－05

2011－10－12 *通讯联系人

董靓靓(1988－)，女，硕士研究生，研究方向:食品检测。

国家自然科学基金(31000761);高等学校博士学科点基金(20113326130001);国家科技支撑计划(2012BAD29B00)。