MK-801对改善实验性创伤性脑损伤后脑细胞线粒体呼吸作用的研究

代文光，秦晓勇，李良慧，宋学良，冯 玥，李 臻

目前，许多实验研究证实创伤性脑损伤后，脑组织缺血、缺氧，神经细胞水肿，同时神经细胞膜离子通透性，中枢神经递质等化学物质及能量代谢、脑血管调节功能均出现障碍。有学者研究发现创伤性脑损伤后脑缺血、神经细胞膜离子通透性、血管调节功能障碍是造成脑水肿的重要原因之一。已用于抗脑水肿的治疗药物及措施很多，研究发现脑缺血期及缺血后再灌流脑线粒体的呼吸功能相继恶化。可能的机制包括脑内自由基的含量变化，脑细胞内的pH值，Ca2+、Mg2+稳态和自由脂肪酸的变化等［1］。Steven等［2］于1986年提出脑缺血时兴奋性氨基酸过度释放，通过作用于突触后受体产生神经毒性作用，参与缺血脑损伤的过程。MK-801系N-甲基-D-天门冬氨酸(N-mechyl-D-aspartate，NMDA)受体拮抗剂，能有效阻滞兴奋性氨基酸与突触后受体结合，从而保护神经元免受损伤，但MK-801能否改善创伤性脑损伤后脑线粒体呼吸功能，目前国内外文献尚未见报道。本实验通过观察大鼠创伤后MK-801治疗前后脑线粒体呼吸控制率(RCR)的变化，为创伤性脑损伤的治疗提供实验依据。

材料与方法

1 动物分组

雄性Wistar大鼠(中国人民解放军野战外科研究所动物实验中心提供)共80只，11～13周龄，体重160～280g。随机分为4组:对照组20只，创伤未治组(非治疗组)20只，治疗24h组(治疗Ⅰ组)20只，治疗72h组(治疗Ⅱ组)20只。

2 动物致伤

气体冲击致伤动物模型制备参考刘海鹏等［3］报道的方法。造成大鼠左大脑半球中等度局部脑挫裂伤，对照组只做动物麻醉及颅骨钻孔，不做冲击致伤。

3 动物处理

(1)对照组:麻醉后左顶颅骨钻孔后缝合头皮，伤后72h断头处死;(2)非治疗组:气体冲击致伤后72h处死;(3)治疗Ⅰ组:气体冲击致伤后，腹腔内立即注射MK-801液1mg/kg(MK-801原粉+0．9%氯化钠注射液配成0．2mg/ml)伤后72h断头处死;(4)治疗Ⅱ组:气体冲击致伤后腹腔内立即注射MK-801液1mg/kg(MK-801原粉+0．9%氯化钠注射液配成 0．2mg/ml)，伤后 24、48h分别重复注射MK-801液1mg/kg(MK-801原粉+0．9%氯化钠注射液配成0．2mg/ml)，伤后72h断头处死。

全部动物均喂以标准颗粒饲料(中国人民解放军野战外科研究所动物实验中心提供)，自由饮水。

所有动物断头处死后，迅速分离脑组织，取大脑半球，去除脑干和小脑，置于0～2°C生理盐水中洗涤数次，立即埋入带有冰渣的预先称取重量的分离递质中，称重后用以分离线粒体。以上操作在30s内完成。

4 线粒体分离与呼吸功能测定

参照Clark等［4］方法进行线粒体分离。线粒体蛋白含量测定按Lowry法［5］，以牛血清蛋白为标准。线粒体呼吸功能测定:参见Chance和Williams［6］的方法，反应池体积为 1．6ml，温度恒定在 30°C，用Clark氧电极测定线粒体氧耗。反应递质(225mmol/L甘露醇;75mmol/L蔗糖;5mmol/L磷酸 盐-Tris，pH7．4;10mmol/LTris-HCl，pH7．4;0．05mmol/L K+-EDTA;5mmol/L KCl)以空气饱和，加入0．1ml线粒体悬液，预温1min后加入1．25mmol/L谷氨酸和苹果酸钠各 10μl。间隔 1min后加入0．2mmol/L ADP 4μl。分别于ADP存在时(Ⅲ态呼吸，ST3)和ADP耗尽后(Ⅳ态呼吸，ST4)测定线粒体氧耗速度，计算呼吸控制率(RCR=ST3/ST4)。

5 电镜观察

将提纯的脑线粒体沉淀1mm3置入3%戊二醛固定液中固定。冲洗后，1%俄酸固定，逐步丙酮脱水，环氧树脂618包埋，制超薄切片H-300型电镜扫描观察，记录并照像。

6 统计学处理

结 果

1 MK-801对创伤性脑损伤大鼠线粒体呼吸功能的影响

实验结果表明:伤后未治组24、72h脑线粒体呼吸功能明显下降，其特点为呼吸Ⅲ态和呼吸控制率明显下降;治疗Ⅰ组尽管呼吸Ⅲ态、呼吸控制率有所恢复，但仍低于对照组(P＜0．01)，其呼吸Ⅲ态及呼吸控制率分别下降至对照组的74．44%和69．74%呼吸Ⅳ态稍有延长，但相差不显著;治疗Ⅱ组呼吸功能与对照组比仍有非常显著差异，较治疗Ⅰ组呼吸Ⅲ态，呼吸控制率有显著升高(P＜0．05)，呼吸Ⅳ态稍有延长，但相差不显著(见表1)。

2 电镜结果

对照组线粒体结构完整;未治组线粒体结构受损严重，嵴断裂，核膜不完整，肿胀明显，空泡变性;治疗Ⅰ组线粒体嵴断裂、肿胀，较未治组轻，部分空泡变性;治疗Ⅱ组线粒体嵴断裂、肿胀，与治疗Ⅰ组无差别，仍有部分空泡变性(图1～4)。

表1 MK-801对创伤性脑损伤大鼠脑线粒体呼吸功能影响(n=20，±s)

表1 MK-801对创伤性脑损伤大鼠脑线粒体呼吸功能影响(n=20，±s)

与对照组比较:*P ＜0．01;与非治组比较:▲P ＜0．01;与治疗Ⅰ组比较:△P ＜0．05

组别 呼吸Ⅲ态 呼吸Ⅳ态 呼吸控制率对照组10．45 ±0．90 3．02 ±0．31 3．47 ±0．24非治疗组 6．25 ±0．74* 3．34 ±0．45 1．87 ±0．34*治疗Ⅰ组 7．79±0．81＊▲ 3．21±0．51 2．41±0．41＊▲治疗Ⅱ组 8．45±0．43＊▲△ 3．18±0．45 2．67±0．31＊▲△

图1 对照组大鼠脑线粒体超微结构，线粒体结构完整，无肿胀，嵴膜完整，无嵴断裂及空泡变性(×12500)

图2 创伤未治组大鼠脑线粒体超微结构，线粒体结构严重受损，嵴断裂，嵴膜不完整，肿胀明显，空泡变性(×12500)

图3 治疗Ⅰ组大鼠脑线粒体超微结构，线粒体嵴断裂，肿胀较未治组轻，部分空泡变性(×12500)

图4 治疗Ⅱ组大鼠脑线粒体超微结构，线粒体嵴断裂、肿胀，与治疗Ⅰ组无差异，仍有部分空泡变性(×12500)

讨 论

1 创伤性脑损伤对脑线粒体呼吸功能的影响

呼吸Ⅲ态(ST3)为在有底物和ADP刺激下线粒体氧化磷酸化能力，呼吸Ⅳ态(ST4)为只有底物刺激下线粒体呼吸链的功能。本实验结果表明脑外伤后ST3均下降，而非治疗组及治疗组呼吸Ⅳ态却较对照组轻度升高，但无统计学意义。呼吸控制率为线粒体呼吸功能的敏感指标，创伤组及治疗组较对照组下降非常显著，治疗组较非治疗组又明显升高。ST3是代表ADP对线粒体氧化呼吸刺激效应的指标，ST3和RCR下降说明ADP对呼吸链电子传递的控制程度降低，反应氧化磷酸化过程在一定程度上脱偶联。也有观点认为，缺氧状态下，线粒体内ATP含量下降，长链脂酰辅酶A和花生四烯酸堆积以及钙超载均可抑制呼吸链上的电子传递［7］。ST4代表ADP耗尽后线粒体维持正常的形态，结构所必需的基础氧耗。创伤性颅脑损伤ST4轻度升高，可能和伤后线粒体内外钙循环加速、ATP/ADP转运载体受抑制有关［8-9］。据此笔者推测，缺氧可能通过多种途径影响线粒体呼吸功能，主要表现为电子传递受阻。目前已有研究表明，急性缺氧引起线粒体变性、坏死，而慢性缺氧则引起线粒体数目增多，mtDNA拷贝数增加，从而达到代偿作用［10-12］。而创伤性颅脑损伤后脑线粒体缺氧在早期主要是由于创伤后脑水肿、脑肿胀、颅内压升高、脑血管舒缩功能障碍以及伤后呼吸暂停窒息等原因造成的急性缺氧，此后由于细胞代谢产物积聚加重缺氧而出现慢性缺氧。

2 MK-801治疗创伤性脑损伤后脑线粒体呼吸功能改善的机制

本实验应用MK-801治疗创伤后脑线粒体呼吸功能较未治组明显改善，其机制目前尚未完全清楚，可能与下列因素有关。

2.1 对细胞钙离子等通透性的影响 MK-801具有维持线粒体内外离子稳态作用。实验表明，线粒体内钙离子超载时引起颅脑损伤后线粒体功能障碍的重要因素，MK-801作为一种强有力的非竞争性的NMDA拮抗剂主要通过拮抗NMDA受体偶联的Ca2+通道，抑制Ca2+内流。同时MK-801可以维持线粒体氧化磷酸化过程，保证较为充足的ATP合成，从而使线粒体膜上的钙泵得以维持线粒体内外Ca2+平衡，从而减轻创伤性脑水肿形成［13-14］。

2.2 对中枢神经递质等化学物质的影响、减轻自由基的损害 颅脑损伤后由于各种因素导致氧自由基产生过程呈“联锁”反应，在很短时间内产生大量的氧自由基，超过了线粒体的清除能力。氧自由基脂质氧化反应的最终代谢产物MDA的含量反应线粒体的氧自由基水平，线粒体SOD的活性反应可以反映线粒体清除自由基的能力，MK-801作为一种强有力的非竞争性的NMDA拮抗剂参与线粒体的氧化磷酸化功能从而保护线粒体的呼吸功能。

2.3 MK-801阻滞兴奋性氨基酸与突触后受体结合的同时也能阻滞正常氨基酸与突触后受体结合，从而使MK-801目前尚难以用于临床治疗创伤性脑损伤。需进一步探索MK-801改善创伤性脑损伤后脑线粒体呼吸功能的机制，为其临床应用提供确切的理论依据。

3 MK-801对创伤性颅脑损伤后脑线粒体超微结构的影响

资料表明，创伤性颅脑损伤后导致脑缺血、缺氧的损伤中，线粒体的改变发生最早，表现为线粒体内Ca2+聚集，造成线粒体肿胀，嵴断裂等细胞器损害［15］。本实验结果显示，正常组视野内线粒体结构完整，无肿胀，峭膜完整，无嵴断裂及空泡变性;未治组线粒体结构受损严重，嵴断裂，核膜不完整，肿胀明显明显，空泡变性;治疗Ⅰ组线粒体嵴断裂，肿胀较未治组轻，部分空泡变性;治疗Ⅱ组线粒体嵴断裂、肿胀与治疗Ⅰ组无差别，仍有部分空泡变性。说明MK-801不仅对创伤性脑损伤后脑线粒体的呼吸功能而且对其超微结构也有改善作用。总之，随着对MK-801改善创伤性脑损伤后脑线粒体呼吸功能的深入研究，必将为临床治疗创伤性颅脑损伤开辟新的途径。

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