肿瘤坏死因子-α与声门不同状态下肺撞击伤关系的研究

吴秋平，闫 进，蒋 力，张在永，闵家新

肺是胸部撞击伤最常累及的人体重要器官，胸部撞击伤后的肺挫伤、急性肺损伤(ALI)、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)都是常见的致死性器官继发性损伤［1］。ALI的实质是各种原因引起的全身炎症反应综合征在肺部的表现，ARDS只是ALI严重阶段。目前认为创伤导致全身性炎症反应和器官功能损害时，肿瘤坏死因子(TNF-α)在机体炎症反应与抗炎反应中起关键作用［2］。TNF-α具有广泛的生物活性，是引起组织细胞损伤的重要递质。胸部撞击致肺损伤的过程中，炎症细胞产生TNF-α的作用尚鲜见报道。为此，本研究采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测伤侧肺组织TNF-αmRNA的表达，为胸部撞击伤后继发性肺损伤提供依据。

材料与方法

1 实验动物及分组

新西兰实验兔54 只，体质量(2．28 ±0．35)kg，雌雄不限，第三军医大学第三附属医院野战外科研究所实验动物中心提供。随机方法分为正常对照组6只，声门开放和紧闭两组各24只，两种声门状态分别按2、4、8、12h 4个时相点又各分为4组，每组6只。

2 致伤方法

1．5%戊巴比妥钠1ml/kg兔耳缘静脉注射麻醉后，颈部切口，行气管插管术，通过使气管导管开放和夹闭来模拟声门开放和紧闭生理状态。致伤动物采用BIM-Ⅱ型生物撞击机，对兔右侧胸部准静态正面撞击，撞击部位为右锁骨中线第4肋间。致伤参数设置为［3］:驱动压力800kPa，压缩量30%，撞击面积 1．77cm2。

3 RT-PCR反应

3.1 肺组织总RNA提取 取1mg肺组织放入加有0．8ml试剂盒的匀浆器中，冰上匀浆。并按操作说明书提取组织中的总RNA，-70°C保存备用。

3.2 基因片段扩增 TNF-α上游引物5’-GTA GCA AAC CCG CAA GTG GA-3’，下游引物 5’-GGC AAT GAT CCC AAA GTA C-3’，长度370bp。以肌动蛋白(β-Actin)为参照，上游引物5’-AGC CAT GTA CGT AGC CAT CC-3，下游引物 5’-CTC TCA GCT GTG GTG GTG GTG AA-3’。引物由北京中山生物技术有限公司合成。试剂盒购自TAKARA公司，逆转录反应体系:MgCl24μl、10 × RNA 缓冲剂 2μl、dNTP 混合物 2μl、RNase 抑制剂0．5μl、AMV 反转录酶 1μl、Oligo dT-接头引物 1μl、样品(≤1ug total RNA)、RNase Free dH2O，反应总体积 20μl。反应条件为42°C 逆转录 30min，99°C 预处理 5min。PCR反应体系如下:dd H2O 14．25μl、10 ×EX Taq buffer(Mg2+free)2．50μl、Mg2+CL 2．00μl、dNTP 2．00μl、EX Taq 0．25μl、Up-primer1．00μl、Dn-primer1．00μl cDNA 2．00μ，体积 25．00μl。扩增条件:94℃ 变性50sec;60℃退火58sec;72℃延伸1min，进行30个循环，72℃再延伸8min，产物-20℃保存备用。

3.3 PCR产物定量分析 样品及内参PCR产物各8μl充分混匀后于1．2%琼脂糖凝胶电泳1h;凝胶成像系统中分析各条带的灰度值，TNF-α与β-Actin比值，应用统计学检验方法对各组数据进行分析。

4 病理学观察

动物活杀后，取伤侧肺组织做光、电镜检查。

5 统计分析

采用SAS6．12软件包对数据作一般描述，对比分析，包括t检验、方差分析，q检验等。

结 果

1 病理改变

大体标本可见胸壁瘀血、肋骨骨折;双肺有散在或点片状或片状出血，以肺上叶和肺门处明显，肺叶可见与肋骨平行的出血性压痕;部分兔可见肺脏撕裂、支气管断裂。光镜可见肺组织呈多灶性、不规则片状出血、支气管内有红细胞、局部性肺水肿或肺不张。电镜下肺泡Ⅱ型细胞退变坏死、微绒毛脱落、板层体空化、线粒体肿大、肺间质粒细胞浸润、毛细血管粒细胞阻塞(图1、2)。

图1 板层体空化，内皮细胞肿胀明显(透射电镜 ×10000)

图2 肺组织大量炎性细胞浸润，血管腔内红细胞和炎性细胞滞留并黏附于血管内皮(HE染色 ×400)

2 肺组织TNF-αmRNA的表达

声门不同状态下撞击侧肺组织中TNF-αmRNA伤后不同时相点有不同的表达，在伤后2h时，声门紧闭与开放两组该指标差别无统计学意义(P＞0．05);至伤后4h时，声门紧闭与开放两组肺组织中TNF-αmRNA达到峰值(声门紧闭组 2．278±0．197，声门开放组 1．686 ± 0．101)，之后该值逐渐下降，伤后 4、8、12h声门紧闭组 TNF-αmRNA 的表达显著高于声门开放组(P＜0．05)(表1)。撞击侧肺组织中TNF-αmRNA各时相点显著高于与对照组(P ＜0．05)。

表1 右肺组织TNF-α mRNA的表达(n=6)

讨 论

肺撞击伤后早期主要表现为因机械性损伤因素导致的肺泡内出血，随着时间的推移逐渐发展为肺间质水肿、炎症细胞浸润等改变。肺组织病理改变也表现为挫伤区域中心的肺泡内出血，大量红细胞浸润，肺泡结构破坏，而其周围可见肺间质肿胀、增宽，间质毛细血管内血流瘀滞，白细胞附壁，间质及肺泡内大量炎症细胞(主要为中性粒细胞)浸润［4］。单纯的机械性损伤因素不能解释上述继发性改变。严重创伤引起机体神经、内分泌和免疫系统的反应，在炎性细胞因子作用下，表现为全身性瀑布式炎症反应，发展到一定程度则演变为多器官功能障碍综合征(MODS)［5］。肺脏首先遭到损害，表现为持续的顽固性低氧血症及呼吸窘迫的临床特点。

TNF-α主要是由单核一巨噬细胞应答各种刺激时所产生的一种细胞因子，其生物活性广泛，与炎症关系密切［6］。它可诱导动物出现急性肺损伤［7］，有研究表明［8-9］:TNF-α主要来源于脂多糖(LPS)刺激的单核、巨噬细胞等，在各种原因所致的ALI过程中，TNF-α主要通过下列途径发挥作用:(1)诱导其它细胞因子，如IL-1β、IL-6、IL-8等前炎细胞因子产生和释放，造成机体损伤的同时，因可通过再激活炎症效应细胞，释放更多的炎性因子，使炎症信号进一步放大和加强，产生“级联放大”作用;(2)直接损伤肺血管内皮细胞和肺泡Ⅱ型上皮;(3)与其它细胞因子相互作用引起肺组织损伤;(4)激活补体和凝血系统，促进炎症在肺组织中的扩散。

本实验结果表明，声门不同状态下撞击侧肺组织中TNF-αmRNA伤后不同时相点有不同的表达，在伤后2h时，声门紧闭与开放两组该指标差别无统计学意义(P＞0．05)，至伤后4h时，声门紧闭与开放两组肺组织中TNF-αmRNA达到峰值(声门紧闭组2．278 ±0．197，声门开放组 1．686 ±0．101)，之后该值逐渐下降。说明炎症早期，肺泡巨嗜细胞激活、TNF-α产生增加，并促使多性核中性白细胞(PMN)聚集、迁移至肺内，使PMN成为分布最广数量最多的炎性细胞，同时又是 TNF-α更大的来源，提示TNF-α参与创伤性肺损伤的发生发展，撞击伤后肺组织中TNF-αmRNA出现过度表达，促进了中性粒细胞的趋化、聚集，可能对肺血管通透性增加、间质水肿、出血坏死及最终导致创伤性ALI的发生起重要作用。

TNF-α参与肺损伤机制较为复杂，目前认为有以下几种观点:TNF-α被视为机体炎症反应的启动物质［10］，它能迅速启动单核-巨噬细胞和内皮细胞，促进趋化因子和黏附因子的合成，促成中性粒细胞在肺内聚集与激活的级联反应［11］。肺血管内皮细胞在炎症因子的作用下受到损伤，血管通透性增加，血管内容物外渗，造成肺水肿［12-13］。TNF-α 不仅发挥直接的内皮细胞损伤作用，还可通过与其受体结合诱导其他细胞因子合成与释放，致使组织发生炎症损伤［14］。本实验直接检测肺组织中 TNF-αmRNA含量，发现肺损伤程度与肺组织中TNF-αmRNA含量成正相关，即肺组织中TNF-αmRNA含量越高，肺损伤程度就越重。本实验伤后4、8、12h声门紧闭组TNF-αmRNA的表达显著高于声门开放组(P＜0．05))，说明声门紧闭状态下肺撞击伤的程度重于声门开放状态。

撞击直接损伤可导致肺脏出血和水肿，是物理因素所造成的原发伤，而内皮细胞和上皮细胞变性、细胞间隙增宽、通透性增强等应视为急性继发性肺损伤。尽管继发性损伤中有撞击参数如驱动压和压缩量等物理因素所致，但从本实验结果来看，细胞因子TNF-α在其中扮演了重要的角色［15］。由于与创伤有关的细胞因子很多，各细胞因子之间相互影响、相互作用，呈网络样。因此，要全面阐述细胞因子在加重肺撞击伤中的作用和地位，需要进一步深入研究。

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