金黄色葡萄球菌肠毒素C2对兔骨髓间充质干细胞增殖和成骨分化的实验研究

董晨辉，王子明，杜全印，王 雨，黄 恺，王爱民

金黄色葡萄球菌肠毒素(staphylococcal enterotoxins，SEs)，属于金黄色葡萄球菌和链球菌产生的家族庞大的致热肠毒素，具有相似的结构、功能和序列的一致性。SEs由金黄色葡萄球菌编码的蛋白质分子，不需要抗原提呈细胞(antigen-presenting cells，APC)处理而直接与主要组织相容性复合体(major histocompatibility complexⅡ，MHCⅡ)类分子结合，导致带有特异性V节段CD34细胞大量增殖。其对T淋巴细胞的刺激能力是普通抗原的10万倍以上，在极低浓度时即可产生很强的免疫反应［1－2］。金葡素注射液(商品名:恩格菲)在以往的临床应用中，常作为抗肿瘤药物应用于各种癌肿，在抗癌方面的研究中已经得到了深入研究［3－4］，但是金黄色葡萄球菌肠毒素 C2(Staphylococcal Enterotoxins C2，SEC2)同时作为一种加快骨折愈合的药物研究，在其作用机制上没有得到广泛重视。

因此，本文就SEC2诱导兔骨髓间充质干细胞(rabbit bone marrowmesenchymal stem cells，rBMSCs)分化的剂量和时间进行系统分析研究，从而为临床的推广打下理论基础。

材料与方法

1 实验材料

新西兰纯种大耳白兔(4周龄)，雌性，体质量400～600g，由第三军医大学大坪医院实验动物中心提供并饲养;自由饮水摄食。实验过程中对动物处置符合2006年科技部发布的《关于善待实验动物的指导性意见》。SEC2(由辽宁大学生命科学院生化教研室惠赠)，紫外分光光度计(BiO－RAD公司)，倒置显微镜、激光共聚显微镜(OLYMPUS公司)，优质胎牛血清(Gibco)，DMEM/F12(1:1)培养基(Hy-Clone)，CD44及CD45(Abcom公司)，碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase，ALP)检测试剂盒(碧云天公司)等。

2 实验方法

2.1 rBMSCs的培养 实验兔在3%戊巴比妥钠(40mg/kg)耳缘静脉麻醉后，侧卧手术台上，于髂后上嵴处剪毛备皮后消毒皮肤，铺无菌洞巾，穿刺取骨髓，实验步骤参考文献［5－6］。倒置显微镜每日观察细胞的生长状态，第3天后半量换液，第10天当观察到少量细胞变为梭形、贴壁，即全量换液，改为条件培养基，此后隔日换1次条件培养基。倒置显微镜隔日观察，贴壁细胞达到80%以上可行传代;直至细胞不能传代、衰老死亡为止。

2.2 rBMSCs CD44以及CD45鉴定结果 取培养第3代细胞，细胞爬片生长48h后采用异硫氰酸荧光素标记的 CD44、CD45抗体(CD44-FITC、CD45-FITC)对培养细胞进行标记，避光抗体孵育12h后，4’，6-二脒基-2-苯基吲哚(4’，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)复染细胞核，于37℃下避光孵育30min，90%丙三醇封片，应用激光共聚焦显微镜检测标记情况。

2.3 在不同SEC2浓度梯度作用下细胞增殖检测 根据文献报道，设定区间为1～500μM，其中设立4个实验组、1个对照组以及1个阳性对照组，阳性对照组选择5mM维生素C;选择处于第3代对数生长期的rBMSCs用不同浓度的肠毒素SEC2溶液(1、10、100、500ng/ml)共培养 24h，应用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法选择吸光值(OD)490nm波长检测诱导细胞增殖的情况。

2.4 成骨诱导作用检测和鉴定 将第3代细胞轻微吹打后，以5×103/cm2接种至六孔板中，随机分为2组。采用碧云天公司ALP测定试剂盒定量测定ALP。各组rBMSCs诱导28d后，消化、离心收集各组细胞，分别用250μl细胞培养上清液悬浮细胞，用细胞超声破碎仪破碎细胞，离心后取上清定量测定ALP，分光光度计检测，波长520nm。茜素红染色进一步鉴定。

2.5 逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)半定量检测成骨细胞目标标记物的表达情况 根据Genbank检索兔相关的GAPDH、骨桥蛋白、胶原-1的基因序列，根据同源性，利用Primer Premier5．0软件设计合成的特异性引物，引物序列如下:GAPDH:(sense)5V-GGG GAG CCA AAA GGG TCA TCA TC-3V，(antisense)5V-GCA GGT TTT TCT AGA CGG CAG GT-3V;骨桥蛋白(osteopontin):(sense)5V-CAC CAT GAG AAT CGC CGT-3V，(antisense)5V-CGT GAC TTT GGG TTT CTA CGC-3V;胶原-1(collagen I):(sense)5V-GCA CTG GAG AGG TGC ACT G-3V，(antisense)5V-GCT GAG TCT CAG GTC GCG-3V;由上海生工生物公司合成。按Trizol法提取细胞总RNA。按照两步法RT-PCR试剂盒操作说明反转录cDNA，并通过PCR扩增，反应时序为:94℃预变性3min，94℃ 变性 30s，54℃ 退火 30s，72℃ 延伸 1min，共30个循环;72℃延伸10min，共5个循环。取扩增产物进行20g/L琼胶糖凝胶电泳;35min后置于紫外凝胶成像仪中进行观察，照相记录。图像用Adobe Photoshop软件去色，转换为TIF格式后用Tatal lab v1．10软件分析目的条带的光密度积分值V值(V值=平均吸光度值×条带面积)，目的基因的表达相对光密度值(Rv):(骨桥蛋白:Rv=Vosteopontin/VGAPDH;胶原-1:RV=VcollagenI/VGAPDH)。

3 统计学分析

采用SPSS16.0统计学软件对实验组和对照组数据进行分析，结果以(±s)表示，各组总体上有无差别采用单因素方差分析，组间比较采用LSD法，P＜0.05具有统计学意义。

结 果

1 rBMSCs形态学观察

原代细胞培养中，在接种4～5h后，细胞开始贴壁，在24h左右可见少量细胞贴壁细胞形态大致呈梭型或者纺锤形生长，细胞核圆形或椭圆形，位置基本居中;而未贴壁的细胞则呈圆形，细胞核不清晰(如图1a)。在细胞培养3～5d，对细胞进行换液;可见细胞团簇样生长，细胞形态均一，胞核大小基本一致(如图1b)。待细胞贴壁率达到80%左右，进行传代培养，传代后第2代(如图1c)至第6代细胞增殖较快，且形态规则(如图1d)。

图1 兔rBMSCs培养倒置显微镜下图片( ×100)

2 rBMSCSs CD44以及 CD45鉴定

实验中rBMSCSs免疫荧光染色鉴定rBMSCSs标志抗原CD44的表达情况，共聚焦显微镜观察可见95%以上rBMSCSs表达CD44(绿色，FITC标记)(图2a～c)，而未检测到CD45的表达(图2d～f);如图2a～f见蓝色标记为rBMSCSs细胞核。

图2 激光共聚焦鉴定rBMSCs表面标记物检测

3 SEC2对rBMSCs细胞增殖的影响

MTT法显示，倒置显微镜下观察细胞的增殖情况，结果显示，不同细胞浓度对细胞的增殖起着不同的作用，1μM至100μM时，对细胞的增殖有渐强的促进作用，而在250μM、500μM组，细胞增殖明显受到抑制(图3)。

图3 不同浓度SEC2对RBMSCS增殖的影响

进一步，根据MTT增殖情况，选择100μMSEC2对RBMSCSs进行诱导，在实验第2、7、14天对细胞镜下观测结果如图4所示，细胞增殖情况明显，且在第16天进行茜素红染色可见明显矿化和钙沉积。

图4 SEC2诱导RBMSCSs成骨分化情况

4 ALP活性检测

结果如表1所示，不同浓度的SEC2诱导RBMSCS后6d、10d及16d ALP活性由强到弱依次是:浓度为100μMSEC2组的细胞ALP活性最强，其余组的ALP活性均较对照组增强(P＜0.05)，但是要弱于10μMSEC2组。

表1 ALP活性检测结果(金氏单位*/100ml)(n=8，±s)

表1 ALP活性检测结果(金氏单位*/100ml)(n=8，±s)

与对照组相比:*P＜0.05，#P＜0.01;*1金氏单位=0.714 U/l

对照组SEC2诱导组1μM 10μM 100μM 500μM6d 9.87±1.18 8.41±2.10 12.24±2.15 18.87±1.18*6.87±2.08 10d 11.95±1.24 12.24±2.12 19.24±1.18* 22.65±2.18# 7.73±1.94 16d 12.87±1.98 17.15±1.84 21.54±1.18* 27.24±2.45#8.15±1.97

5 应用100μMSEC2与rBMSCSs共培养检测骨桥蛋白mRNA以及胶原-1-mRNA的变化情况

根据 MTT检测结果，选择 100μMSEC2与RBMSCSs共培养 0、2、7、16d 后，RT-PCR 半定量方法检测骨桥蛋白和胶原-1 mRNA的相对表达量;结果显示:随着共培养时间的延长，骨桥蛋白和胶原-1的表达量有着明显的增加趋势，P＜0.03，具有统计学意义(图5)。

图5 骨桥蛋白以及胶原-1 mRNA的相对表达量

讨 论

金葡素注射液又名骨折愈合刺激素(商品名:恩格菲)，是利用现代生物技术从金黄色葡萄球菌的代谢产物中提取的含 有多种生物活性成分的新型生物制剂。其中富含各种生长调控因子、鸟氨酸及内、外源性酶。它能通过多种生物活性分子的相互作用，促进骨折区微血管形成，同时增加骨细胞及周围组织微循环，起到加速骨折愈合的作用［7－8］。目前，对于金葡素注射液的成分检测已经确认，其中主要的有效成分是SEC2［9］，其分子机制不详。耿佳等［10］研究表明，金葡素注射液可治疗早期股骨头坏死的研究表明:金葡素注射液具有促进血管再生和骨组织形成的作用，能够有效促进早期股骨头缺血性坏死的修复，而用明胶海绵作为载体吸附金葡素注射液后植入减压孔道后，能加速股骨头坏死的修复。

研究表明，人骨髓间充质干细胞(human bone marrowmesenchymal stem Cells，hBMSCs)具有则增殖活跃及多向分化潜能，它在不同的诱导条件下，能向成骨细胞、成软骨细胞等中胚层及神经外胚层组织细胞分化［11］。因此，hBMSCSs可以作为良好的组织工程种子细胞向骨细胞、成骨细胞以及软骨细胞分化［12－13］;己有报道把hBMSCSs复合于生物支架材料治疗骨缺损。

国内的研究中，对于SEC2研究多集中于金葡素注射液为主要方向，金葡素注射液主要通过两种途径加快骨代谢，促进骨的愈合，主要表现为:促进毛细血管增生，改善局部血供;促进成骨细胞分化成熟。然而，金葡素注射液中的主要成分SEC2作用于体外培养的成骨细胞，可显著促进成骨细胞的矿化功能;而主要存在的问题:联合应用抗坏血酸则会有更好的成骨作用，具体的机制仍不详;并且在rBMSCs培养发现，SEC2能促进rBMSCs向成骨细胞分化和成熟，从而达到促进成骨细胞生成，加速骨折的愈合;同时观察到rBMSCs在高浓度SEC2的诱导下增殖减慢，这可能与高浓度的SEC2细胞毒性增强，对细胞的增殖抑制有关。

ALP是成骨细胞分化早期重要指标之一［14］，它标志着成骨分化的程度。ALP活性越强，表明成骨分化程度越高。实验中发现RBMSCs在诱导后第7天时就可以呈现阳性表达，而对照组则为阴性，这说明SEC2诱导后的rBMSCs具有成骨特性。成骨诱导培养显示在第7天时诱导组明显可以看出细胞形态的改变，有类似钙结节样改变，在第16天茜素红染色可见明显矿化和钙沉积;进一步RT-PCR检测成骨分化相关因子mRNA变化中发现，rBMSCSs经成SEC2诱导分化后，胶原-1有明显的增加趋势;根据已有文献［12］，胶原-1由成骨细胞以原胶原的形式分泌，在基质中被迅速裂解，是骨有机质的主要成分，约占骨基质蛋白的80% ～90%。本实验通过胶原-1 mRNA相对表达量明显增加，表明诱导后的细胞合成能力增强。骨桥蛋白同样是人体主要的非胶原蛋白，能调节羟基磷灰石晶体生长;因此，骨桥蛋白被认为是成骨细胞成熟分化的标志，实验表明:实验组的骨桥蛋白含量明显高于对照组，差异有统计学意义，充分说明SEC2具有促进rBMSCs向成骨细胞分化作用。

总之，本实验证实了应用SEC2与rBMSCSs共培养后，在极低浓度可促进细胞增殖，同时诱导细胞向成骨细胞分化发现，增加细胞胞浆中骨桥蛋白和胶原-1的表达，从而证实SEC2具有成骨细胞分化作用，为下一步行研究SEC2的分子机制打下理论基础。

［1］ Wood AC，Todd I，Cockayne A，et al．Staphylococcal enterotpxins and the immune system［J］．FEMS Microbiol Lett，1991，3(3):121 －133．

［2］ Gillaspy AF，Iandolo JJ，Moselio S．Encyclopedia of microbiology［J］．Oxford:Academic Press，2009，36(9)293 －303．

［3］ Landman GW，Groeneveld PH．Staphylococcal toxic shock syndrome，superantigenicity and hypersensitivity［J］．Clin Infect Dis，2010，50(9):1326 －1340．

［4］ Cheng X，Cao P，Ji X，et al．Antitumour response of a double mutant of staphylococcal enterotoxin C2 with the decreased affinity for MHC class II molecule［J］．Scand J Immunol，2010，71(3):169 － 175．

［5］ Chen ZZ，Jiang XD，Zhang LL，et al．Beneficial effect of autologous transplantation of bone marrowstromal cells and endothelial progenitor cells on cerebral ischemia in rabbits［J］．Neurosci Lett，2008，445(1):36 －41．

［6］ Roostaeian J，Carlsen B，Simhaee D，et al．Characterization of growth and osteogenic differentiation of rabbit bone marrowstromal cells［J］．J Surg Res，2006，133(2):76 －83．

［7］余建平，苏云星，刘芳．胶原－明胶海绵作为金葡素注射液载体修复骨缺损的实验研究［J］．山西医药杂志，2008，37(1):26 －28．

［8］冯文岭，郑旺．胶原蛋白膜作为金葡素注射液载体修复骨缺损的实验研究［J］．中国修复重建外科杂志，2005，19(5):350－353．

［9］ Ding D，Huang P，Sun HY，et al．Identification of protein components and quantitative immunoassay for SEC2 in staphylococcin injection［J］．J Pharm Biomed Anal，2009，50(1):79－85.

［10］耿佳，张元和，唐磊．金葡素注射液治疗兔早期股骨头缺血性坏死的研究［J］．中国医学工程，2011，19(7):54－55．

［11］ Jorgensen C，Gordeladze J，Noel D．Tissue engineering through autologous mesenchymal stem cells［J］．Curr Opin Biotechnol，2004，15(5):406 －410．

［12］ Fisher M，Hyzy S，Guldberg RE，et al．Regeneration of bone marrowafter tibial ablation in immunocompromised rats is age dependent［J］．Bone，2009，46(2):396 －401．

［13］ Quintavalla J，Uzielfusi S，Yin J，et al．Fluorescently labeled mesenchymal stem cells(MSCs)maintain multilineage potential and can be detected following implantation into articular cartilage defects［J］．Biomaterials，2002，23(1):109－119．

［14］ Lock J，Nguyen TY，Liu H．Nanophase hydroxyapatite and poly(lactide－co－glycolide)composites promote human mesenchymal stem cell adhesion and osteogenic differentiation in vitro［J］．J Mater Sci Material Med，2012，23(10):1007－1012.