急性肺损伤实验动物模型

陈 勇，周继红，欧阳瑶

急性肺损伤(ALI)和其更严重阶段的急性呼吸窘迫综合征(ARDS)是由心源性以外的各种肺内外致病因素所导致的急性缺氧性呼吸衰竭，由于其造成了较大的临床压力和沉重的社会经济负担［1－2］，近些年来对ALI/ARDS实验动物模型的研究也越来越多。本文就近年来急性肺损伤实验动物模型研究进展作一综述。

1 如何建立理想的模型

理想的肺损伤实验动物模型应该复制人类肺损伤的发生机制和后果，这其中主要包括病理和生理学上的变化。但是，目前为止没有任何一个实验动物模型可以完全复制人类急性肺损伤的所有特征，大多肺损伤实验动物模型只是针对人类肺损伤的单个或少数几个病理生理特征进行复制，如换气功能异常、肺顺应性下降、肺实质损伤和肺泡毛细血管膜通透性增加等。正是因为人类肺损伤疾病本身的复杂性和多样性，才使得急性肺损伤模型的建立方式和推论层出不穷，至今没有公认的建模标准。

1．1 实验动物肺损伤和人类肺损伤的不同 动物和人类在解剖学上和生理学上有许多不同。例如，小鼠的呼吸频率(250～300次/min)远高于人类呼吸频率(12～16次/min);相比于人，小鼠和大鼠的肺部肺泡较少且血气屏障较薄;小鼠只有6～8级支气管分支，而人类却有20级或更多;小鼠的终末端细支气管注入肺泡管和肺泡，而人类呼吸性细支气管注入肺泡管和肺泡;鼠科类动物气道远端比人类气道远端有更多的Clara细胞和大量的支气管淋巴样组织等。值得注意的是，鼠科类动物急性肺损伤时肺部病理很少出现典型的透明膜现象。另一个容易忽略的是人与动物之间的生活环境的不同。大多动物都是被饲养在高度控制的环境中，这使得动物接触到外界的病菌很有限，由此人或实验动物急性肺损伤时，固有免疫系统对各自肺病理形态发展和变化的影响会出现差异。

1．2 实验动物的大小 进行急性肺损伤建模时，实验动物的体型也是选择实验动物必须要考虑的因素。研究由脓毒症引起的ALI/ARDS治疗方案时，较小体型动物，如鼠科类，难以出现理想实验结果的一个重要原因就是未能在实验过程中正确地实施机械通气，因为给体型较小的动物实施肺通气较困难;相反，对体型较大的脓毒症引起的肺损伤实验动物实施机械通气较易，这一类型动物脓毒症致伤后的病理生理改变也更接近人类，缺点是体型较大的动物价格昂贵［3］。血液的采集也会因动物体型大小有差异。从较大体型动物，如兔、绵羊、犬类和非人类灵长类动物身上获取血液标更容易本且标本量更充足。需要研究监控生理指标时，如进行多时间段的血气分析、血浆中细胞因子水平检测和白细胞计数，血液标本量是否充足就尤为关键。

1．3 肺损伤实验动物模型的评估

1．3．1 急性肺损伤动物实验模型病理生理变化观察时间点的选取 ALI/ARDS的临床征象是呼吸困难、非心源性水肿、肺顺应性下降和胸部X线诊断两肺出现弥漫性浸润阴影。以上征象进展迅速，常常在初始致伤后24～48h出现［4－5］;ALI/ARDS病人肺损伤后病理变化主要由3个相互重叠的阶段组成:渗出期、增殖期和纤维化期。初始致伤后12～24h内是渗出期，这一时期可能持续7d［6］。这一阶段特征是急性炎症反应，会释放大量促炎和抗炎细胞因子，紧接着中性粒细胞在肺部大量聚集。第二个阶段是增殖期，这一阶段一般在致伤后第3d开始并持续2周［6］。这一时期Ⅱ型肺泡上皮细胞增殖并取代Ⅰ型肺泡上皮细胞，成纤维细胞浸润肺泡腔。ALI/ARDS最后一阶段纤维化期，这一时期在伤后持续5～28d，此期属于修复阶段。由于病人间个体差异，不是所有ALI/ARDS病人都会出现以上特征。

罹患ALI/ARDS的病人其生理和病理变化伴随时间的发展是难以监测的。相反，肺损伤动物实验是在高度控制的条件下进行，在不同的时间点动物的生理和病理变化情况较易获得。但是，急性肺损伤实验动物造模的时间点最好限制在24h以内，因为此阶段是肺损伤发生炎症的高峰期［7－8］，而在之后大多数急性肺损伤动物模型通常肺部炎症基本消退，Rojas等［9］在其内毒素致小鼠肺损伤实验中，发现内毒素注入24h内血清中大多数细胞因子浓度水平升高，之后缓慢下降，而48h后，病理结果显示肺部炎症消退。

1．3．2 影像学检查评估 临床工作中，影像学检查是确诊ALI/ARDS一项重要指标，典型的影像学诊断是双肺出现弥漫性浸润阴影。急性肺损伤动物实验研究中，所采用的影像学检查主要是X线和CT。但是实验动物的大小和实验室设备上的限制在一定程度上阻碍了影像学诊断在实验动物中的研究，尤其是CT检测成本较高。影像学检查较适用于体格较大的动物，如兔、狗、绵羊和猪等动物。

1．3．3 组织学评估 Matute-Bello等在 2008年［10］和2011［7］年发表的文章中认为，为了复制出更接近ALI/ARDS病人病理生理特征，急性肺损伤实验动物模型应该复制出急性肺损伤时肺上皮细胞和内皮细胞病理变化特征，并且肺部应该有炎症表现发表的文章中认为，为了复制出更接近ALI/ARDS病人病理生理特征，急性肺损伤实验动物模型应该复制出急性肺损伤时肺上皮细胞和内皮细胞病理变化特征，并且肺部应该有炎症表现。笔者认为如何从病理学上复制出更接近ALI/ARDS病人肺部改变，应该根据实验研究的具体方向和实验研究的目的进行选择，几种常见的急性肺损伤模型肺部组织病理变化见(表1)。

表1 常见肺损伤实验动物模型病理表现

1．3．4 生理学评估 急性肺损伤病人主要生理特征是通气/血流比值异常、严重的血氧不足、肺顺应性下降和肺泡液清除功能受损。急性肺损伤实验动物模型会因为动物类别、致伤方式、观察时间和实验操作等因素产生不同的生理改变。

低氧血症是评估急性肺损伤实验动物建模合理的一个重要指标，由于急性肺损伤实验动物建模并没有公认的标准，所以以前不少研究者建模时参考1994年欧美联盟协会根据临床病例统计分析提出的ALI/ARDS诊断标准［19］，但Matute-Bello等［7］认为这一标准直接应用于判断急性肺损伤实验动物伤情并不合理，它只能在一定程度上反映出实验动物肺损伤的程度。笔者认为目前尚未有评估急性肺损伤实验动物建模公认的标准，而动物实验的目的是最大可能复制临床疾病的各种特征并据此进行干预实验服务于临床，所以将临床所采用的诊断标准应用于评价实验动物模型造模还是有一定价值的。

肺顺应性下降是ALI/ARDS的另一个显著特征，这一特征主要是由于肺水肿和肺不张引起，在实验动物模型中这一指标较易监测。主要评价的指标包括呼吸节律、气道峰压、平均气道压、气道平台压、潮气量、呼气末正压、每分钟呼气量和肺静态顺应性。虽然这一评估方式比较有效，但是其成本不仅昂贵，而且仅通常对体格较大的实验动物检测才有较为理想的结果。

1．3．5 急性肺损伤炎性反应 理想的急性肺损伤炎症反应指标应该与肺病理生理变化紧密相互联系。这些指标应该可靠、易复制、检测方法简便经济且特异性强。急性肺损伤实验动物常用检测炎症反应的标本有支气管肺泡灌洗液(bronchocalveolar lavage fluid，BALF)、肺水肿液、肺组织匀浆液和血清。所有指标中研究较多，同时也被认为是评估急性肺损伤程度较为重要的是支气管肺泡灌洗液中的中性粒细胞数量、髓过氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)浓度和肺损伤时肺部释放到BALF中的炎性细胞因子浓度。尽管急性肺损伤时肺泡腔中炎性因子表达显著，但是目前临床上对ALI/ARDS病人抗炎治疗收效甚微。

2 几种肺损伤实验动物模型

急性肺损伤实验动物建模方式有很多种，致伤因素的不同所产生的肺损伤病理生理表现也有所不同，因为篇幅所限本文就不一一介绍了，仅简要介绍实验室中几种常见的急性肺损伤实验动物模型。

2．1 内毒素致急性肺损伤模型 内毒素致伤模型多采用脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)，通过吸入、静脉注射或腹腔注射入实验动物。LPS是革兰阴性细菌，细胞膜表面的主要结构，由三部分共价连接而成，即O特异性抗原多糖、核心多糖及脂质A。内毒素注入实验动物后，实验动物处于全身炎症反应状态，表现为全身炎症反应综合征(SIRS)，刺激机体释放炎性细胞因子，从而引起瀑布样级联反应，使肺泡上皮细胞及血管内皮细胞受损，间隙增大，大分子物质透过血管进入肺间质及肺泡内，从而引起肺部一系列的病理生理改变。LPS引起急性肺损伤动物肺泡腔和间质中性粒细胞募集、肺泡壁变薄和蛋白水肿液聚集在肺泡腔;而LPS引起的细胞损伤主要与凋亡相关，上皮细胞在动物注入LPS后迅速凋亡并先于其他组织损伤发生［20］。

不同的动物对LPS的反应均不同。肺内有肺血管内皮巨噬细胞(pulmonary intravsascular macrophages，PIM)的动物如绵羊、牛、猪、猫、马等动物注入少量的LPS就会引起显著的脓毒症和肺损伤症状，肺内没有PIM的动物如狗、小鼠、大鼠和兔需要高剂量的LPS才会引起肺损伤。上世纪90年代，研究LPS致小动物急性肺损伤难以获得满意的治疗效果，当时Deitch［21］认为很多的动物实验并没有复制出人类肺损伤接受治疗的条件，Benjamin等［3］认为很多小动物肺损伤治疗干预实验中没有对小动物进行机械通气，因为人类ALI/ARDS进行的支持疗法就包含了机械通气，对鼠科类动物实行机械通气会比较困难。但是随着科技的进步，目前人类使用的呼吸机可应用于小动物并且小动物呼吸机也广泛运用，这为今后开展更进一步的小动物急性肺损伤实验研究提供了帮助。体型较大的动物耐受力强，并方便实施人类所使用呼吸机通气，所以笔者认为，资金宽裕的条件下，采用体型较大的动物进行更接近复制人类ALI/ARDS生理变化。

2．2 机械通气致肺损伤模型(ventilator-induced lung injury，VILI) 上世纪80年代和90年期间，一些实验动物研究表明机械通气会造成肺部炎症反应和损伤，这些研究改变了重症监护室护理病人的方式。机械所致肺损伤动物模型主要出现的病理损伤是肺间质变薄和肺泡中性粒细胞浸润。其中体型较大的动物易现透明膜现象，而鼠科类动物则较少出现。

实验动物VILI与临床上所致VILI有几点不同。最明显的不同是损伤时间和肺的大小，大多动物机械肺损伤实验研究在1～8h内完成，而临床上采集的机械通气肺损伤数据需24h或更长时间;另外，人和动物的肺部结构差异会影响到伤后病理组织表现。

固有免疫系统在VILI中发挥了重要作用，这已成为共识。许多生物学因子在VILI发生时自身会有明显变化，问题也随之而来，众多改变的生物学因子与VILI有多少关联?事实上，即使“专家”也难以给出确切答案。Wilson和Takata［22］根据研究成果提出3点筛选与VILI相关的炎症递质:(1)选择上游因子作为研究指标;(2)应认识到VILI的病理进程中生物学因子起关键调节作用，而不仅是起一般的细胞炎症功能;(3)目标因子/通路的调节功能应该有说服力、客观和生理相关性。

2．3 “二次打击”急性肺损伤模型 上世纪90年代提出了“二次打击”概念，ALI/ARDS病人发生的机制非常复杂，很少因为一种“打击”因素发生。“二次打击”模式源于临床观察提出，现已得到临床和研究人员的普遍认可。“二次打击”所致肺损伤原理大致是由一个不太严重的创伤或其他某种方式(第一次打击)预激机体，而随后的感染或非感染因素造成的第二次损害引发炎症反应失控造成肺损伤［23－24］。常见的“二次打击”"急性肺损伤模型有失血-内毒素、缺血再灌注-盲肠穿刺结扎、休克-内毒素、肺挫伤－内毒素等模型。临床ALI/ARDS病人发生是一个复杂和多因素参与的疾病过程，应用“二次打击”急性肺损伤模型能更好解释ALI的发生，也更符合临床ALI/ARDS病人的病理生理过程。

3 ARDS“柏林定义”

2011年欧洲危重病协会重新修订了ARDS的定义，即“柏林定义”［25］，这一标准据经验性评估来自于4个多中心临床的4 188名ARDS病人数据和3个单中心生理学试验的269名ARDS病人数据，并采用 meta分析所起草(表2)。1994年欧美联合会议所提出的ARDS诊断标准已被许多实验机构作为衡量急性肺损伤实验动物建模是否成功的一个重要指标。新的ARDS诊断标准主要的变化是剔除了“ALI”这一定义和肺动脉楔压(pulmonary artery wedge pressure，PAWP)≤18mmHg这一ARDS诊断标准。未来进行急性肺损伤实验动物建模是否可以参考ARDS“柏林定义”这一诊断标准，需要进一步的实验验证。

表2 ARDS“柏林定义”

急性肺损伤动物模型是了解ARDS发病机制和探索其治疗方法的重要手段。没有任何一个动物模型能复制人类急性肺损伤的所有特征，无论哪种类型的急性肺损伤实验动物模型都有其局限性。但是肺损伤实验动物模型的研究对诊疗人类急性肺损伤还是发挥了很多很大作用，如动物模型实验中意外发现了间充质干细胞旁分泌作用可减轻急性肺损伤程度。通过急性肺损伤实验动物模型研究，目前临床上针对急性肺损伤治疗已经有了一定进展，但仍需要不断改进肺损伤实验动物建模，尽可能复制不同类型的急性肺损伤患者病理生理学特点，这样才能更好将实验室的成果应用到临床上，由此减轻急性肺损伤患者病情并改善急性肺损伤患者预后。

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