自噬参与DJ-1保护大鼠黑质多巴胺能神经元抵抗鱼藤酮损伤

刘慧丰 杨巍巍 高 华 杨 慧*

(1.北京王府中西医结合医院综合内科，北京 100049;2.首都医科大学基础医学院神经生物学系北京脑重大疾病研究院，北京 100069;3.首都医科大学附属北京天坛医院北京神经外科研究所，北京 100050)

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是一种以运动障碍为主要临床特征的复杂的神经退行性病变。目前，PD的确切病因尚不明了，但许多研究［1-2］倾向PD的发生是遗传和环境因素共同作用的结果。

DJ-1是个多功能蛋白，其基因突变可能导致PD发生。有研究［1］表明过表达野生型DJ-1可抵抗氧化应激引起的损伤。而敲除DJ-1后可增加细胞或动物模型对氧化应激损伤的敏感性［2-3］。另外，RNA干扰试验证实DJ-1可以抑制用百草枯处理的SH-SY5Y细胞的自噬囊泡生成，增加了细胞凋亡数量［3］。

鱼藤酮作为广泛使用的脂溶性杀虫剂，是较明确的线粒体复合物I抑制剂，可以引起氧化应激和细胞凋亡［4］。持续、低剂量的经颈静脉或皮下给予鱼藤酮被证明能选择性损伤黑质多巴胺能神经元［5］。但是，目前DJ-1是否降低鱼藤酮所致多巴胺能神经元损伤及其具体机制目前尚不清楚。因此，阐明DJ-1对于多巴胺能细胞的保护机制，有助于为防治PD提供可能的药物靶点。

1 材料与方法

1.1 材料

1)试剂:RIPA裂解液(北京普利莱基因技术有限公司);LC3抗体(Abcam公司);actin抗体(Sigma公司);TH抗体(Sigma公司);DJ-1抗体(Chemicon公司);beclin1抗体(Proteintech Group公司);phospho-mTOR抗体 (Cell Signaling公司)，mTOR抗体(Cell Signaling公司)，2种腺相关病毒是由带绿色荧光蛋白(GFP)标签和人源的DJ-1基因及其空载体分别构建而成，它们分别为LV-GFP-DJ-1和空载对照LV-GFP(由上海吉凯基因技术有限公司提供技术服务);鱼藤酮(Sigma公司);水合氯醛购于中国沈阳试剂厂，HRP标记的二抗购于KPL公司，2种腺相关病毒携带人源DJ-1及其空载体分别为AAVr-DJ-1(DJ-1)和空载对照AAVr-LacZ(LacZ)，由本实验室自己构建。

2)动物:成年Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠，体质量230～250g，等级:SPF，医学实验动物质量合格证书，许可证编号:SCXK(京)2012－0001，首都医科大学实验动物部提供。

1.2 方法

1)实验分组:采用数字表法随机将114只SD雄性大鼠分为6组，假手术组(20只):单纯切开头皮，颅骨钻孔后缝合皮肤作为假手术组;实验组1(30只):注射携带DJ-1基因的腺相关病毒(AAVr-DJ-1，DJ-1);对照组1(22只):注射携带LacZ基因的腺相关病毒(LacZ)作为空载体对照组1;实验组2(10只):注射携带GFP-DJ-1基因的腺相关病毒(GFP-DJ-1);对照组2(10只):注射携带GFP基因的腺相关病毒(GFP);对照组3(22只):注射0.9%的氯化钠注射液(NS)。

腺相关病毒感染后4周，实验组和对照组共5组动物均于黑质纹状体通路内侧前脑束注射鱼藤酮;假手术组注射等剂量的DMSO混合溶液。

手术后4周，105只大鼠存活(其中实验组1为27只，对照组1为21只，实验组2为8只，对照组2为9只，对照组3为20只，假手术组3为20只)。不同时间点不同组别各检测指标的动物数情况详见表1。

表1 手术后4周各组实验动物数Tab.1 Number of animals underwent different treatment methods at 4 weeks after operation

2)大鼠脑定位注射腺相关病毒及鱼藤酮:SD大鼠用6%的水合氯醛腹腔注射麻醉，按6 m L/kg注射。将麻醉好的大鼠固定在脑立体定位仪上，消毒开皮，暴露颅骨。腺相关病毒注射到大鼠左侧黑质，注射位点为前囟后(－)5.2 mm，正中线左旁开(L)2.0 mm，硬脑膜下(V)7.5 mm，门齿棒低于耳间线(－)2.4 mm，鱼藤酮注射到黑质纹状体通路内侧前脑束，注射位点为前囟后(－)4.4 mm，正中线左旁开(L)1.1 mm，硬脑膜下(V)7.9 mm，门齿棒低于耳间线(－)2.4 mm。在手术显微镜下立体定位上述注射位点，用牙科钻于相应的颅骨处小心钻开一小孔，用Hamilton微量注射器，按1 μL/min的速度推进，每注射完1 μL的液体后，留针1 min，换点注射和注射完毕时，都需留针15 min，然后缓缓退出Hamilton微量注射器;于伤口处撒布少许AMP粉末，以消炎抗菌，然后全层缝合皮肤切口;将动物放置于温暖的环境中直至大鼠苏醒。腺相关病毒注射滴度为107TU，鱼藤酮溶液浓度为1.5 mg/mL，溶剂为二甲基桠枫(DMSO)。

3)大鼠灌注取材及切片:SD大鼠用6%的水合氯醛注射麻醉，按6 mL/kg腹腔注射。0.9%的氯化钠注射液冲洗血管，再用4%的多聚甲醛灌注固定，完毕后，取完整脑，去除小脑帘和大脑幕，放入4℃的4%的多聚甲醛溶液中继续固定。24 h后，将脑组织放入30%的蔗糖PB溶液中4℃脱水2～3 d，即可用冰冻切片机(德国Leica)切片，脑片厚度为40 μm。

4)免疫组织化学染色:取SD大鼠黑质部位脑片(40 μm)，用0.01 mol/L PBS 洗3 遍，每次10 min，然后用0.3%PBST处理15 min。用5%山羊血清室温孵育1 h，加入鼠源anti-TH抗体(1∶10 000)，或者抗兔源anti-DJ-1抗体(1∶1 000)4℃过夜，次日用PBS洗3次，加入相应的FITC标记的羊抗鼠(或兔)免疫球蛋白抗体(1∶500)，37℃避光孵育1 h，PBS冲洗3次，DAPI复染5 min，PBS冲洗3次，封片后用共聚焦扫描显微镜观察。

5)Western blotting检测:抽提SD大鼠黑质全细胞蛋白，选用RIPA蛋白裂解液进行细胞裂解，BCA法测蛋白浓度，SDS PAGE电泳，半湿转法将蛋白转移至PVDF膜，8% 脱脂牛奶封闭1 h，分别入beclin1(1∶1 000)，mTOR(1∶1 000)，p-mTOR(1∶1 000)，LC3(1∶1 000)，actin(1∶5 000)抗体，4 ℃ 过夜。0.1%TBST洗膜3次，入相应辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔(或鼠)免疫球蛋白抗体中(1∶5 000)，室温孵育1 h，洗膜同前。加入化学发光液，于暗室化学发光及显影、定影。

1.3 统计学方法

使用SPSS for Windows11.5进行统计分析，实验数据用均数±标准误(E)表示，组间比较行单因素方差分析(One way ANOVA)，部分实验数据行2×2析因方差分析。用Sigma-plot绘图软件作图。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 AAVr-DJ-1在大鼠黑质内的表达情况检测

Confocal结果显示腺相关病毒感染4周时，注射病毒侧黑质部位可见DJ-1阳性细胞数显著增加(图1 A)，而对侧仅有少量 DJ-1阳性细胞(图1B)，证明AAVr-DJ-1成功在注射侧黑质稳定大量表达。

2.2 DJ-1过表达缓解鱼藤酮致大鼠黑质多巴胺能神经元损伤

鱼藤酮损伤黑质4周后免疫荧光染色显示，外源性DJ-1(绿色)可同时表达在神经元中及其他胶质细胞中。但是，约60%的外源性DJ-1表达在酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase，TH)阳性神经元中(图2)。

图1 大鼠脑内注射AAVr-DJ-1病毒上清4周时黑质部位观察DJ-1阳性细胞情况Fig.1 DJ-1 positive cells were observed following unilateral AAVr-DJ-1 injection into rats brain for 4 weeks

图2 过表达DJ-1对黑质多巴胺神经元的影响Fig.2 The effect of DJ－1 overexpression on dopaminergic neurons in SN

在鱼藤酮损伤4周后，比较各组SD大鼠损伤侧黑质TH(红色)与外源性DJ-1(绿色)阳性神经元数目。结果显示，与假手术组(Sham)相比，单纯鱼藤酮注射组(Ro)大鼠黑质TH+神经元降低显著;而过表达外源性DJ-1后，可显著缓解鱼藤酮所致DA能神经元丢失(图2)。

行2×2析因方差分析，结果显示，注射DJ-1后大鼠黑质TH阳性神经元数目较DJ-1注射之前增高，差异有统计学意义(P＜0.05);不考虑DJ-1注射这一因素时，注射Ro后大鼠黑质TH阳性神经元数目较Ro注射之前降低且差异有统计学意义(P＜0.05);DJ-1注射与Ro注射的交互作用对于大鼠黑质TH阳性神经元有显著影响，即过表达DJ-1后可缓解Ro注射对于TH阳性神经元的损伤，差异有统计学意义(P＜0.05)(表 2，3)。

表2 DJ-1、鱼藤酮注射前后大鼠黑质TH阳性神经元数目的描述Tab.2 Description of TH positive neuron numbers in the substantia nigra of rats with or without D J-1 or rotenone injected

表3 析因实验结果的方差分析表Tab.3 Factorial experiment results of the ANOVA table

2.3 过表达DJ-1对自噬相关蛋白表达的影响

同LacZ组和NS组相比，鱼藤酮损伤4周时，DJ-1组的 LC3-Ⅱ表达上调，差异有统计学意义(P＜0.05);而LacZ组与NS组比较，LC3Ⅱ/Ⅰ的比值差异无统计学意义(图3)。

2.4 DJ-1对自噬通路PI3K/mTOR通路的影响

Western blotting结果显示，与 NS、LacZ组相比，DJ-1过表达组的p-mTOR的水平降低(图4A)，而Beclin1水平则明显增加(图4 B)。

3 讨论

DJ-1是一种重要的保护性蛋白，在许多反应中发挥神经保护作用，如DJ-1基因缺陷增加对氧化应激的敏感性［6］;过表达野生型DJ-1，可保护神经元抵抗氧化应激［1，7］，提高 HSP70的表达水平，抑制突变型α-SYN A53T引起的蛋白聚集和细胞毒性［8-9］。本课题组以前的研究［10］发现，过表达DJ-1可以抵抗鱼藤酮对多巴胺能细胞的损伤，但具体机制不清。腺相关病毒(AAV)对非分裂细胞有高感染效率且表达稳定，所以本实验应用携带DJ-1基因的AAV颗粒感染大鼠模型。

图3 DJ-1能明显上调大鼠黑质自噬水平Fig.3 DJ－1 could enhance autophagy levels in SN of rats

图4 DJ-1对自噬通路PI3K/mTOR通路的影响Fig.4 The effects of DJ－1 on autophagic signalling pathway－PI3K/mTOR

PD病理特征为中脑黑质多巴胺能神经元选择性、进行性丢失。作为多巴胺合成的限速酶，酪氨酸羟化酶(TH)则广泛表达在黑质多巴胺能神经元中。本研究应用免疫荧光染色方法进一步验证外源性DJ-1是否在多巴胺能神经元中，即TH阳性神经元中高表达并发挥保护作用。结果发现外源性DJ-1(绿色)可同时表达在神经元中及其他胶质细胞中。但是，约60%的外源性DJ-1表达在TH阳性神经元中。

鱼藤酮具有极强的亲脂性，在不依赖多巴胺转运体的情况下自由通过血脑脊液屏障和细胞膜并聚集在亚细胞器如线粒体内。本实验利用鱼藤酮建立PD大鼠模型，免疫组化结果显示，在鱼藤酮损伤4周后，与假手术组(Sham)相比，单纯鱼藤酮注射组(Ro)大鼠黑质TH+神经元降低显著;而过表达外源性DJ-1后，可显著缓解鱼藤酮所致DA能神经元丢失。以上结果提示，DJ-1过表达对鱼藤酮引起的大鼠多巴胺能神经元的损伤有抵抗作用，延缓多巴胺能神经元的退行性变。

自噬作用在细胞分化、增生、生存、死亡及对环境应激的应答方面极为关键，对防止某些疾病如肿瘤、肌病、神经变性疾病以及对抵御病原微生物的感染和延缓衰老、延长寿命等方面发挥重要作用［11］。它是广泛存在于真核细胞内的一种溶酶体依赖性的降解途径，可以吞噬无用的生物大分子和衰老的细胞器为新的细胞结构的构建提供能量和原料并可以通过清除聚集蛋白和受损细胞器起到保护作用。在自噬体形成过程中，LC3(microtubule-associated protein 1 light chain 3)由胞质形式LC3-I(18 000)转化为LC3-Ⅱ(16 000)形式并定位于自噬体双层膜表面，参与自噬体代谢的全过程。因此LC3-Ⅱ成为自噬检测的分子标记。研究［4］表明在SH-SY5Y细胞中应用自噬的诱导剂雷帕霉素可以减弱鱼藤酮引起的线粒体功能失调，清除聚集的泛素化蛋白，最终减少细胞死亡数量。DJ-1可以影响包括蛋白酶体在内的蛋白清除途径。干扰DJ-1后，能够减弱百草枯诱导的自噬，增加SH-SY5Y细胞活力［2-3］。PI3K/mTOR通路是调控自噬发生的主要通路。mTOR是哺乳动物的雷帕霉素靶向蛋白，是自噬发生的启动分子，对自噬起着负性调控作用。Beclin 1则通过形成3型PI3K复合体参与自噬的调节，Beclin的下游产物磷脂酰肌醇则是自噬体双层膜结构延长所必需的原料。另有文献［12-13］报道，在低氧时DJ-1可以影响Akt和mTOR的活性。以上文献提示，DJ-1同自噬的发生有着密切的关系，那么自噬是否是DJ-1保护作用机制之一呢?蛋白免疫印迹实验结果显示DJ-1组黑质Beclin1蛋白表达增加以及LC3Ⅱ/Ⅰ的比值较假手术组及LacZ和NS组的比值增加1倍，另外3组之间差异无统计学意义。大鼠模型的结果证实在DJ-1起保护作用的同时有自噬现象的存在。根据已有的文献和本研究的试验结果，笔者推测在给予鱼藤酮后，DJ-1激活影响mTOR/PI3K通路，上调Beclin1的表达，从而上调自噬水平，清除受损的线粒体发生线粒体自噬。

总之，本实验发现无论在体水平的高低，DJ-1可以诱导自噬的发生，并且发挥保护性作用，这是对DJ-1具有保护性功能机制的一种新的发现和阐述，为PD的治疗提供了一种新的思路和探索。

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