血管内皮生长因子及其受体表达水平下调增加垂体腺瘤卒中风险

贾 旺 刘 晓 鲁润春 贾桂军 倪 明 孙 静 徐志卿

(1.首都医科大学附属北京天坛医院神经外科，北京 100050;2.首都医科大学基础医学院病理学系，北京 100069;3.首都医科大学基础医学院神经生物学系，北京 100069)

垂体腺瘤是颅内常见的良性肿瘤，在颅内肿瘤的发生率中仅次于胶质瘤和脑膜瘤，占颅内肿瘤总数的15%［1］。垂体腺瘤的生长过程中部分病例会出现肿瘤内出血，称作肿瘤卒中。垂体腺瘤卒中发生的时间和程度差异很大，轻微者没有临床症状，严重者可以造成患者迅速失明。卒中的发生与肿瘤的血管生成能力关系密切。血管内皮生长因子(vascu-lar endothelial growth factor，VEGF)通过其受体(vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR)发挥血管生成作用，可能与垂体瘤卒中的生物学行为有关。本研究通过定量PCR检测垂体腺瘤中最普遍的促血管生成VEGF剪接变体VEGF165及其受体的表达水平，以探讨VEGF及其受体与垂体腺瘤卒中发生之间的关系。

1 材料与方法

1.1 临床资料

标本取自2011年3月至2012年12月首都医科大学附属北京天坛医院术后病理证实为垂体腺瘤的患者，总共166例，标本取自肿瘤接近中心部位，每份标本质量约为5 g。回顾了完整的病史、术前内分泌化验，磁共振(magnetic resonance imaging，MRI)影像资料则用来评估肿瘤大小、囊变、出血。肿瘤大小依靠MRI增强像上肿瘤的最大直径判断;肿瘤囊变定义为T1WI(T1 weighted image)低或等信号，T2WI(T2 weighted image)高信号;肿瘤出血定义为T1WI等信号，T2WI低信号或T1WI高信号，T2WI低或高信号;(图1)。

图1 MRI显示垂体腺瘤卒中及囊变Fig.1 MRI images of intratumor hemorrhage and cystic lesions of pituitary adenomas

1.2 标本收集并反转录为cDNA

手术切除肿瘤组织后立即置入液氮中保存。按照RNeasy Lipid Tissue Mini Kit试剂盒流程提取RNA，－80℃保存。SuperscriptⅢ First－Strand Synthesis System for RT－PCR试剂盒流程将RNA反转录为cDNA，－20℃保存。

1.3 Real-time PCR

QPCR反应体系(SYBGreen):采用SYBR Green法，试剂为SYBR Green mixture(美国ABI公司)。每个反应体系 ddH2O 8 μL 、Primer F 0.5 μL、Primer R 0.5 μL、cDNA 1 μL 、SYBGreen 10 μL，总共 20 μL，每个样本重复3次。循环条件:50℃ 2 min，95℃ 8 min，95℃ 15 s，60℃ 1 min，共40 个循环，40℃ 30 s。采用Roche LightCycler®480Ⅱ系统的分析功能，把GAPDH设定为内参，得出RQ值反应mRNA相对表达量。引物序列详见表1。

表1 QPCR引物序列Tab.1 Primers used in the present study

1.4 统计学方法

采用SPSS 17.0软件进行统计学分析。本文主要指标为计量资料，先进行正态性检验，符合正态性条件时，采用t检验或方差分析;不符合正态性条件时，采用非参数检验;对VEGF及其受体的RQ值行正态性检验(P＜0.10)，均不符合正态分布。计量数据采用中位数和四分位数间距［M(P25，P75)］表示，组间行非参数检验。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 VEGF及其受体表达与患者年龄、性别的关系

本组入选病例166例，平均年龄45.4(19～74)岁;＜45岁者79例(47.6%)，≥45岁者87例(52.4%)，组间VEGF及其受体表达差异均无统计学意义。男性83例(50.0%)，女性83例(50.0%)，组间VEGF及其受体表达差异均无统计学意义，详见表2。

2.2 VEGF及其受体表达与肿瘤大小的关系

肿瘤最大直径1～2cm的小腺瘤组30例(18.1%)，2～3 cm的大腺瘤组66例(39.7%)，大于3cm的巨大腺瘤组70例(42.2%)，组间VEGF及其受体表达差异均无统计学意义，详见表3。

2.3 VEGF及其受体表达与肿瘤内部囊变的关系

肿瘤磁共振检查未见囊变组86例(51.8%)，灶状囊变组 42例(25.3%)，显著囊变组 38例(22.9%)，组间VEGF及其受体表达差异均无统计学意义，详见表3。

表2 VEGF、VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3表达水平与年龄和性别的关系Tab.2 Age and gender of the patients and expression levels of VEGF，VEGFR-1，VEGFR-2，VEGFR-3

表3 VEGF、VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3表达水平与临床表现信息表Tab.3 Clinical information of the patients and expression levels of VEGF，VEGFR-1，VEGFR-2，VEGFR-3

2.4 VEGF及其受体表达与肿瘤卒中的关系

肿瘤影像学检查及术中证实肿瘤内无出血组132例(79.5%)，出血组34例(20.5%)，组间VEGF及其受体表达差异均无统计学意义。在96例无功能腺瘤组，无出血组77例(80.2%)，出血组19例(19.8%)，VEGF、VEGFR-3的表达差异有统计学意义(P=0.047，P=0.026)，VEGFR-1的表达接近有意义的结果，而VEGFR-2的表达差异均无统计学意义，详见表3。

3 讨论

垂体腺瘤内部的出血称为垂体腺瘤卒中，发生率为1.5% 到27.7%，是其他颅内肿瘤的5.4倍［2-3］。垂体腺瘤内部的出血也可以不出现症状或症状轻微，仅在常规行CT或MRI检查时发现，称之为亚临床卒中，在垂体巨大腺瘤中发生率约为14%～22%，明显高于小肿瘤［4-5］。肿瘤内部迅速而大量的出血称为垂体腺瘤急性卒中，可以引起肿瘤体积短时间内快速增长，压迫视交叉并刺激鞍区附近的硬脑膜，造成患者出现突然而剧烈的头痛、视力障碍、眼肌麻痹，是垂体腺瘤严重的合并症。垂体腺瘤急性卒中的流行病学发生率约为5%，而术中证实卒中发生率约为2%［6］。

垂体腺瘤卒中在垂体腺瘤的生长过程中出现时间早晚和出血量差异很大，部分肿瘤体积较小却出现了比较明显的卒中，而有些肿瘤体积很大却不出现肿瘤内部的出血，或者仅仅出现灶状出血。临床中还可以观察到少数病例出现肿瘤比较完全的卒中后肿瘤消失。垂体腺瘤卒中出现生物学行为差异的原因尚未明确。

肿瘤内部的出血与新生血管的生成和肿瘤的生长状态有关，垂体腺瘤也不例外。目前已经发现的血管生成因子中VEGF被认为是最重要的一种［7-8］。对于VEGF在肿瘤中的作用，既往研究［9-12］对于VEGF与垂体腺瘤的肿瘤内出血、囊变、肿瘤侵袭及内分泌分型等方面存在着不同的意见。VEGF受体的功能也是研究的热点，VEGFR-1在正常垂体组织的内分泌细胞及垂体腺瘤上皮细胞表达，在MtT-S细胞系中发现，VEGF通过VEGFR-1促进肿瘤细胞的增生;VEGFR-2表达于血管内皮细胞，与肿瘤血管生成密切相关，且认为VEGF对正常垂体内血管完整性及通透性的调节有重要作用，通过其受体VEGFR-2及neuropilin-1 NRP-1 协同完成［13］。既往研究［14-16］显示，垂体腺瘤的血管化程度较正常垂体组织差，临床中肿瘤生长亦较缓慢，但垂体腺瘤组织中受体 VEGFR-1及VEGFR-2的表达相比正常垂体组织却明显增高［13，17-18］。

Arita等［9］(2004)报道垂体腺瘤中VEGF的过度表达引起血管通透性增加，促进水分渗出及囊肿形成，导致腺瘤内部压力增加，而垂体腺瘤血液的供应部分来自于垂体门脉系统，即使轻微的压力增加亦可部分阻断肿瘤的血流灌注，继而引起肿瘤的坏死出血，之后的一些研究［9，16，19-21］得出了类似的结论，但也有一些报道否认它们之间存在联系，如Kong等［22］检测了垂体腺瘤外周血中VEGF的表达，亦没有得到有意义的结果。Jin Kim等［23］用RT-PCR技术检测88例垂体腺瘤标本的VEGF表达水平，发现VEGF表达水平增高与垂体腺瘤卒中相关，并认为通过检测其表达可以预测垂体腺瘤卒中的发生。

本研究总共166例标本，其中无出血组132例(79.5%)，出血组 34例(20.5%)。两组间比较VEGF及其受体的表达差异均无统计学意义，进一步按照内分泌功能分组后，却发现了有意义的结果。在本组研究中，无功能腺瘤 96例，占全部病例的57.8%，其中无出血组77例(80.2%)，出血组19例(19.8%)，出血比例与全组差异无统计学意义，但VEGF及其受体VEGFR-3的表达在肿瘤卒中病例中明显降低，差异有统计学意义，VEGF-1的表达虽差异无统计学意义，但表达水平明显降低，而VEGFR-2则无明显变化。由于肿瘤内部的囊变也与肿瘤内部的血管通透性变化及出血后的吸收机化有关，尤其是具有快速视力下降和剧烈头痛病史没有及时就医，而磁共振检查显示肿瘤内部有明显囊变的病例，本研究认为也是肿瘤卒中的自然转归。本组肿瘤囊性变的病例分组差异未见统计学意义也与卒中组的统计分析一致。

无功能腺瘤在垂体腺瘤中最常见，因而最具有代表性。在垂体腺瘤中，血管的完整性及通透功能需要正常水平VEGF维持［9，13］，在VEGF表达水平下降时，血管正常功能受到影响，引起血管破裂出血，而受体VEGFR-1及VEGFR-3的表达明显下降表明出血后肿瘤的增生能力降低。与血管生成相关的受体VEGFR-2的表达水平未见明显变化也从反面证实肿瘤的卒中出血不是由于内部的新生血管过度增生引起，这一点作为良性肿瘤的垂体腺瘤与其他高度恶性的肿瘤卒中出血的机制可能有所不同。因此，本研究认为无功能腺瘤卒中的原因与VEGF表达水平显著下调，血管不能维持其正常功能有关。

与既往的研究［12，24-27］相比，本研究病例数充足，分组统计详尽，同时对VEGF及3个受体亚型进行检测，特别是运用实时定量PCR进行检测，克服了既往定性或半定量研究手段的缺点，结果可信度更高。本研究证实无功能垂体腺瘤的VEGF及VEGFR-3的表达下降与肿瘤卒中有关，但其上游调节机制和血管内皮细胞内对调控的反应还有待将来进一步研究。

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