膝骨关节炎滑膜不同部位基质金属蛋白酶3的表达及临床意义

李守龙 艾依热提·买买提 潘海涛 曾 峥

(1.首都医科大学附属北京天坛医院骨科，北京 100050;2.新疆油田公司明园职工医院外科，乌鲁木齐 830000)

膝骨关节炎(osteoarthritis of knee，KOA)炎性反应滑膜、滑膜内血管组织及浸润的炎性反应细胞可分泌炎性介质及软骨溶解酶至关节滑液中，通过关节滑液破坏软骨细胞外基质［1］。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)与其抑制剂即金属蛋白酶组织抑制因子(tissue inhibitors of matrix metalloprotein-ase，TIMPs)的平衡是维系关节软骨细胞外基质稳定的关键因素。基质金属蛋白酶3(matrix metalloproteinase-3，MMP-3)是导致软骨破坏的关键酶，当MMP-3的活性增高，并超过了TIMPs的增高程度时，MMPs/TIMPs失平衡，促使关节软骨基质的降解，导致KOA的发生。临床工作中发现KOA患者膝内侧疼痛症状出现早，关节间隙狭窄明显。本实验通过研究KOA滑膜不同部位MMP-3的表达强度及其临床意义，讨论MMP-3在KOA发病中的作用，为KOA临床治疗提供依据。

1 材料与方法

1.1 临床资料和标本来源

选取首都医科大学附属北京天坛医院2010年7月至2012年3月收治的48例KOA患者为研究对象，其中男性16例，女性32例，年龄48～63岁，平均年龄53.4岁，病史最短1.5年，最长12年，平均4.5年。纳入标准:①符合骨关节炎的诊断依据［2］，并经膝关节镜检查术证实;②双膝均患KOA者，以症状严重侧入选;③无心血管、肝、肾等重要脏器病变;④排除活动性消化性溃疡及其病史;⑤排除类风湿、感染性关节炎等其他关节疾患;⑥入选病例术前4周未使用非甾体类消炎药(non-steroid anti-inflammatory drugs，NSAIDs)、皮质醇或具有消炎镇痛作用的中药制剂。⑦术前均有膝关节疼痛。术前拍摄站立位患膝正侧位X线片进行Kellgren-Lawrence分级。所有患者均行膝关节镜检及关节滑膜清理术，术中分别取内侧间室、髌上囊及外侧间室滑膜。

1.2 主要试剂及耗材

兔抗人MMP-3多克隆抗体及一抗稀释液由北京嘉美诺斯生物科技有限公司提供，二抗EDTA 9.0及PV-6000即用型二步法检测试剂盒由北京中杉金桥生物技术有限公司提供，CR机(Siemens公司，德国)由首都医科大学附属北京天坛医院放射科提供。莱卡自动脱水机、DAB显色剂、PBS缓冲液、蒸馏水由北京天坛医院病理科提供。

1.3 实验方法

术中所取滑膜标本用体积分数为10%的中性甲醛固定，莱卡自动脱水机脱水(全程14 h)，58℃～60℃石蜡包埋，切取4 μm厚切片，行针对MMP-3的HE染色及免疫组化染色。切片常规脱蜡至水。0.3%H2O2中室温孵育10 min。微波抗原修复，92℃～98℃，5 min。正常山羊血清封闭液室温孵育20 min，滴加一抗，置于37℃温箱中60 min。滴加生物素化的羊抗兔Ⅱ抗，置于37℃的温箱中60 min，DAB显色。阴性对照标本用PBS代替一抗。苏木素复染、脱水、透明、封片、镜下观察。

1.4 结果判定

1)免疫组化染色结果判定:采用半定量积分法［3］，分别对每张切片的阳性细胞染色强度及阳性细胞率进行分级记分:①0、1、2、3分依次表示阳性细胞染色强度为阴性、弱阳性、阳性及强阳性;②阳性细胞率:每张切片计数5个40×10倍视野细胞，根据阳性细胞所占比例分级:无着色细胞或仅有﹤10%观察细胞着色，0分;阳性细胞数10%～25%，1分;阳性细胞数25%～50%，2分;阳性细胞数50%～70%，3分;阳性细胞数70%～100%，4分。根据2项之和确定滑膜MMP-3表达强度。

2)临床评分方法:应用综合评分方法［4］，根据患者病史及临床查体、X线所见，汇总临床症状(疼痛、行走困难)、体征(关节肿胀、关节活动受限程度)及X线K-L分级5项指标，各项指标按无、轻、中、重分别计为0、1、2、3分，最高分为15分，对KOA患者作出临床评分。

1.5 统计学方法

使用统计学软件SPSS 17.0进行数据处理，计量数据以均数±标准差()表示。不同部位滑膜MMP-3表达强度比较采用单因素重复测量数据方差分析和两两比较检验。滑膜MMP-3表达强度与临床评分的关系采用相关系数r表示。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 KOA滑膜不同部位MMP-3表达强度比较

MMP-3在KOA滑膜标本中的滑膜衬里细胞层、滑膜衬里下层均见阳性表达，其中主要是滑膜细胞、血管内皮细胞和浸润的淋巴细胞、单核细胞着色明显，表现为胞核深染，胞质中可见棕黄色或棕褐色颗粒分布(图1)。细胞外基质中也可见少量棕黄色颗粒均匀分布。MMP-3表达强度:内侧间室滑膜＞髌上囊滑膜＞外侧间室滑膜，两两间差异有统计学意义，详见表1。

图1 KOA滑膜MMP-3免疫组化染色Fig.1 Immunohistochemical staining for MMP－3 in synovial membrane of KOA(400×)

图2 KOA滑膜不同部位MMP-3表达强度与临床评分的相关关系Fig.2 Correlation of MMP－3 expression intensity in different sites of KOA synovial membrane with clinical scores KOA:osteoarthritis of knee;MMP-3:matrix metalloproteinase-3.

表1 KOA滑膜不同部位MMP-3的表达强度及临床评分Tab.1 Expression of MMP－3 in different sites of KOA synovial membrane and clinical scores()

表1 KOA滑膜不同部位MMP-3的表达强度及临床评分Tab.1 Expression of MMP－3 in different sites of KOA synovial membrane and clinical scores()

*P＜0.001 comparisons of every two sites in expression intensity of MMP-3 apso showed significant difference;KOA:osteoarthritis of knee;MMP-3:matrix metalloproteinase.

Sites Expression intensity Medial compartment 3.45±0.22*Suprapatellar bursa 2.69±0.21*Lateral compartment 1.99±0.16*Clinical scores 8.75±2.18 F 0.000 70.706 P

2.2 KOA滑膜不同部位MMP-3表达强度与临床评分相关性

经多元线性回归分析，临床评分与内侧间室滑膜、髌上囊滑膜、外侧间室滑膜MMP-3表达强度间无多元线性关系(P=0.572)。内侧间室及髌上囊滑膜MMP-3表达强度与临床评分分别呈正相关关系(图2)，相关系数分别为 r1=0.894(P=0.000)，r2=0.803(P=0.000)。外侧间室滑膜MMP-3表达强度与临床评分无相关性r3=0.485(P=0.057)。

3 讨论

KOA滑膜炎导致的关节疼痛是KOA患者疼痛的重要原因，疼痛多是KOA患者的最初表现且先于X线或MRI的影像学表现而出现，滑膜炎性反应参与了KOA 的整个病理过程［5-6］。有研究［7］发现，KOA 滑膜中浸润的炎性细胞包括T辅助淋巴细胞、抑制性T淋巴细胞、B淋巴细胞及单核巨噬细胞，主要存在于滑膜衬里细胞层、滑膜衬里细胞下层以及小血管周围。Hollander等［8］发现在离体条件下，由滑膜所分泌的关节滑液破坏关节软骨的作用强于血清中细胞因子，差异有统计学意义。滑膜释放的炎性介质IL-1β等可通过旁分泌或自分泌作用，使MMPs活性及含量增加，从而导致软骨基质分解，加剧KOA的进程;IL-1β以及TNF-α又可通过激活细胞间因子NF-κB，后者可抑制软骨再生所必需的转录因子SOX9的表达，从而抑制软骨合成、修复，进一步加重关节软骨破坏［9］，呈现出一种恶性循环。

KOA滑膜炎性反应是关节软骨或软骨下骨破坏崩解后形成的二氢焦磷酸钙结晶、软骨碎屑导致的继发反应［7］，KOA滑膜为了溶解吸收关节腔内磨损脱落的关节软骨碎屑，代偿性增生、肥厚并分泌软骨溶解酶(包括MMP-3)，软骨碎屑溶解的同时，正常的关节软骨也同样被溶解。Ishimaru等［10］证实患膝疼痛的KOA患者关节液及血清中MMP-3浓度明显高于无痛患者，且MMP-3浓度与疼痛程度强烈相关，但与X线分级无相关性，由此可推测疼痛与KOA导致的滑膜炎性反应有关，进而与滑膜中MMP-3表达强度呈正相关。目前测定滑膜中MMP-3表达强度的研究报道少见，本实验应用免疫组织化学方法研究KOA滑膜不同部位MMP-3的表达强度，结果发现内侧间室滑膜中MMP-3的表达，内侧间室＞髌上囊＞外侧间室。临床工作中发现，患膝内侧及髌上囊疼痛、压痛症状往往较外侧重，其中以膝内侧症状为最重，且关节间隙明显狭窄。结合实验结果，可以推测KOA膝内侧间室滑膜MMP-3表达强度较其他部位滑膜升高可能为患膝内侧临床症状显著的原因之一。

MMP-3的表达增高导致的KOA关节软骨破坏以及滑膜炎性反应可以刺激体内伤害性感受系统，除产生主观痛觉外，释放到关节腔内的炎性反应介质如P物质(P substance，SP)、降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide，CGRP)、缓激肽等能够降低外周伤害性感受器的冲动产生阈值，使其对痛性刺激更易感［11-13］。陈百成等［14］发现神经生长因子 (nerve growth factor，NGF)和SP在KOA内下方滑膜中表达增多，感觉神经纤维在内下方滑膜处增多，内下方滑膜对伤害性刺激更敏感。另有研究［15］表明NGF在KOA患者滑膜组织的表达与KOA患者疼痛以及关节功能障碍呈正相关，内侧间室滑膜CGRP表达较外侧间室及髌上囊增多［16］，内侧间室SP染色阳性神经纤维分布较正常密集，分布密度与疼痛VAS评分正相关［17］，这些与本实验得出的MMP-3在内侧间室滑膜表达较强的结果的意义相同，都可能是膝内侧疼痛和压痛症状显著的原因。滑膜内阳性神经纤维存在于滑膜衬里细胞层，并有神经纤维分支走向关节腔方向，而在衬里细胞下层，SP阳性细胞主要存在于滑膜血管周围，相当数量的SP阳性纤维存在于半月板与滑膜连接处［18］，结合上述研究发现，这支持临床上行膝关节镜下滑膜清理术后患膝疼痛减轻的现象，切除增生、肥厚滑膜可使滑膜中发放痛觉冲动的伤害性感受器减少，同时阻断了痛觉冲动的向上传导，临床上表现为患膝疼痛减轻。

国内外关于髌上囊滑膜与外侧滑膜中MMP-3表达强度或SP阳性神经纤维分布密度以及NGF表达强度比较的研究较少，本研究除发现内侧间室滑膜MMP-3表达强度高于髌上囊及外侧间室滑膜外，还得出髌上囊滑膜MMP-3表达强度高于外侧间室滑膜，虽然实验结果受滑膜标本甲醛中贮存时间以及抗体纯度、免疫组化染色过程中操作技术水平、镜下观片判断等因素的影响，但入选患者亦存在不同程度的髌上囊部位压痛，故髌上囊滑膜MMP-3表达强度高于外侧间室滑膜的结论仍具有一定参考意义，它为临床上决定滑膜切除范围提供了依据，即关节镜滑膜清理术中主要切除内侧间室、髌上囊滑膜可以缓解疼痛症状。

KOA临床表现主要涉及关节疼痛、肿胀、活动行走受限等方面，本研究结合患者上述临床表现及膝关节平片Kellgren-Lawrence分级，对KOA组患者进行临床评分，并将其分别与内侧间室滑膜、髌上囊滑膜及外侧间室滑膜中MMP-3表达强度进行相关性分析，内侧间室及髌上囊滑膜MMP-3表达强度与临床评分呈正相关关系(P=0.000)，据此可认为KOA患者临床评分与膝滑膜病变程度可相互反映，应用MMP-3拮抗剂如四环素类抗生素、他汀类［19-20］等药物，并联合关节镜下滑膜病变有限切除可缓解临床症状、改善关节功能，亦能减缓炎性反应滑膜分泌至关节滑液中的炎性介质及MMP-3等软骨溶解酶对于软骨细胞外基质的破坏，进而减缓KOA的进展，对于存在疼痛症状的早期KOA患者以及主观不愿行膝关节置换而选择保守治疗的晚期KOA患者，具有广阔的临床应用前景。

［1］王国金，卫小春，张志强，等.血清和关节液中基质金属蛋白酶－3及其抑制因子－1的检测及临床意义［J］.中华风湿病学杂志，2006，10(5):311-313.

［2］ 中华医学会骨科学分会.骨关节炎诊治指南(2007年版)［J］.中华骨科杂志，2007，27(10):793-795.

［3］李亚平，王旭辉，陆志，等.膝骨性关节炎患者滑膜和滑液中基质金属蛋白酶－3表达水平的研究［J］.宁夏医学杂志，2009，31(12):1086 －1088.

［4］陈游，孙材江，方建珍，等.不同程度膝骨关节炎患者滑液中几种细胞因子水平变化［J］.中国临床康复，2002，6(10):1426-1427.

［5］Benito M J，Veale D J，FitzGerald O，et al.Synovial tissue inflammation in early and late osteoarthritis［J］.Ann Rheum Dis，2005，64(9):1263-1267.

［6］Ayral X，Pickering E H，Woodworth T G，et al.Synovitis:a potential predictive factor of structural progression of medial tibiofemoral knee osteoarthritis results of a 1 year longitudinal arthroscopic study in 422 patients［J］.Osteoarthritis Cartilage，2005，13(5):361-367.

［7］Révell P A，Mayston V，Lalor P，et al.The synovial membrane in osteoarthritis:a histological study including the characterisation of the cellularinfiltrate present in inflammatory osteoarthritis using monoclonal antibodies［J］.Ann Rheuma Dis，1988，47(4):300-307.

［8］Hollander A P，Atkins R M，Eastwood D M，et al.Degradation of human cartilage by synovial fluid but not cytokines in vitro［J］.Ann Rheuma Dis，1991，50(1):57-58.

［9］Wehling N，Palmer G D，Pilapil C，et al.Interleukin-1 beta and tumor necrosis factor-alpha inhibit chondrogenesis by human mesenchymal stem cells through NF-kappa B dependent pathways［J］.Arthritis Rheum，2009，60(3):801-812.

［10］ Ishimaru J I，Oguma Y，Goss A N.Matrix metalloproteinase and tissue inhibitor of metalloproteinase in serum and lavage synovial fluid of patients with temporomandibular joint disorders［J］.Br J Oral Maxillofac Surg，2000，38(4):354-359.

［11］沈海丽，夏亚一，王翠芳，等.骨关节炎的疼痛机制研究进展［J］.中华风湿病学杂志，2010，10(11):769-771.

［12］焦春莲，曹向黎，郑佳佳，等.综合康复治疗方法在膝骨性关节炎中的应用［J］中国煤炭工业医学杂志，2011，14(1):

［13］谭利，王池凤，刘伟波，等.医用臭氧治疗膝关节骨关节炎效果观察［J］.解放军医药杂志，2012，24(1):27-29.

［14］陈百成，王晓峰，张静，等.膝关节骨关节炎滑膜中神经生长因子和P物质水平测试与观察［J］.中华骨科杂志，2003，23(3):156-160.

［15］王大勇，史晨辉，董金波，等.膝骨性关节炎滑膜神经纤维分布和神经突起因子表达及意义［J］.临床和实验医学杂志，2011，10(8):569-571.

［16］ Saito T，Koshino T.Distribution of neuropeptides in synovium of the knee with osteoarthritis［J］.Clin Orthop Relat Res，2000(376):172-182.

［17］何锐，杨柳，郭林，等.髌内侧滑膜皱襞中表达P物质的神经分布与髌股关节痛的相关性［J］.中华骨科杂志，2009，29(6):567-571.

［18］Iwasaki A，Inoue K，Hukuda S.Distribution of neuropeptide-containing nerve fibers in the synovium and adjacent bone of the rat knee joint［J］.Clinical and Experimental heumatology，1995，13(2):173-178.

［19］朱可为，王万春.多西环素对兔膝关节骨关节炎软骨及滑膜中MMP-3和TIMP-1 mRNA表达的影响［J］.中国医师杂志，2012，14(8):1038-1045.

［20］ Clockaerts S，Van Osch G J，Bastiaansen-Jenniskens Y M，et al.Statin use is associated with reduced incidence and progression of knee osteoarthritis in the Rotterdam study［J］.Ann Rheum Dis，2012，71(7):1264.