水提法提取海藻多糖及其对α-淀粉酶的抑制活性研究

王文武，闵玉涛，陶 敬，马庆一

(1.中州大学 化工食品学院，郑州 450044 ；2.郑州轻工业学院 食品与生物工程学院,郑州 450002)

海藻为海产藻类植物的通称，在我国资源十分丰富。海藻中含有丰富的多糖，占其干重的50%以上。海藻多糖具有抗辐射、抗肿瘤、抗氧化及抗病毒等[1-4]多种生物活性，近年来的研究[5-6]表明，海藻多糖具有较好的降糖效果，其降糖机理是抑制α-葡萄糖苷酶的活性，延缓血糖生成。

本文采用水提法提取海藻多糖，以胰α-淀粉酶为靶酶，4-硝基酚-α-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)作为底物，采用体外消化模型，研究海藻多糖对α-淀粉酶的抑制作用，探索其降糖机理。

1 材料与方法

1.1 实验材料及主要试剂

海藻：购自郑州市中药城，去杂后于40℃干燥，粉碎至40目备用；4-硝基苯-α- D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)；胰α-淀粉酶。

1.2 实验方法

1.2.1 海藻多糖的提取方法

取100g海藻粉末，加1000mL水，胶体磨处理5min，80℃下水浴提取10h，趁热抽滤，收集滤液。在滤渣中加入5倍体积的水提取5h，趁热抽滤，合并滤液。滤液离心后减压浓缩(水浴40℃)至原体积的四分之一，加3倍体积乙醇沉淀24h，离心收集沉淀，得水提海藻多糖。

1.2.2 海藻多糖的跟踪检测

1.2.2.1 定性检测

α-萘酚试验(Molisch紫环反应)：取检品的水溶液1mL，加5%萘酚试液数滴振摇后，沿管壁滴入5～6滴浓硫酸，使之分成两液层，待2～3 min后，如果两层液面出现紫红色环，证明有糖、多糖或甙类。

1.2.2.2 粗多糖得率的计算

取3套称量瓶，于105℃烘至恒重。分别取海藻多糖水溶液1mL，移入有编号的称量瓶中，于105 ℃烘至恒重，做3组平行试验。计算得率。

1.2.3 海藻多糖的初步纯化

1.2.3.1 脱色

活性炭脱色法：海藻多糖粗提物水溶液加热至70～80℃，加入活性炭与硅藻土 (11)，放置过夜脱色，然后离心抽滤，取滤液。

双氧水脱色法：海藻多糖粗提物水溶液加热至50℃，缓慢加入30%的双氧水至浅黄色，保温2h，残留的双氧水用亚硫酸钠还原。

1.2.3.2 除蛋白

1.2.4 海藻多糖抑制淀粉酶效果的测定

将PNPG、缓冲溶液和海藻多糖水溶液于室温下在比色皿中恒定5min，加入胰淀粉酶立即震荡，计时，于400nm下测定吸光度，每分钟读取一次吸光值，同时做PNPG的空白对照实验，以减去底物自身水解产生的误差。

表1 测定反应体系

注：PNPG浓度为0.5mmol/L，胰α-淀粉酶浓度为5mg/mL，缓冲溶液pH为6.81，多糖浓度根据试验要求而定。

反应体系见表1，以反应15min时的吸光度值为基准计算各组分的抑制率，抑制率计算公式：

1.2.5 海藻多糖的抑制动力学实验

测定不同浓度水提多糖对酶活性的影响。 多糖浓度分别为5mg/mL，10mg/mL，12mg/mL，反应体系同表1。

2 结果与讨论

2.1 海藻多糖的提取

2.1.1 海藻多糖的提取率

多糖的提取率为7.8%，提取液颜色较深，具有一定的粘度。水提多糖的过程较慢，但成本低，提取率高。水提所得的是极性强、分子量大的多糖。

2.1.2 不同提取时间对多糖提取的影响

80℃下分别提取2h，5h，10h，18h的多糖，提取效果见表2。

表2 不同提取时间对水提多糖质地的影响

水提法提取多糖，用胶体磨做前处理后，海藻粉的水溶液较粘稠，不同提取时间对海藻粉水溶液的粘稠度影响也不同。多糖的提取率与提取时间有关，适当延长提取时间可使多糖提取充分。80℃，pH7.0，提取10h，海藻多糖得率可达7.8%。但18h的提取率反而下降，这主要是由于随着加热时间的延长，溶液越来越粘稠，无法正常抽滤，导致多糖损失。本实验采用热水浸提海藻多糖，操作简便快速，所用试剂易得且成本低，多糖得率高，符合实验研究和大规模生产的需要。

2.2 海藻多糖的脱色

多糖中若存在过多的色素，不仅影响多糖的色泽，而且会降低多糖的纯度。活性炭脱色效果没有双氧水脱色效果明显，但它是靠吸附作用脱色，抽滤后滤液中没有残留。而双氧水会有部分残留，影响多糖的性质测定，还需加入还原剂中和，操作繁琐，故采用活性炭脱色法。

2.3 海藻多糖降糖活性的研究

根据底物浓度为0.5mmol/mL，反应时间15min时，不同浓度的水提多糖与酶作用结果的吸光度值计算出浓度，作抑制率-抑制剂浓度图，如图1所示。

图1 水提多糖抑制剂浓度与抑制率关系图

由图1可知， 随着多糖用量的增加，其抑制活性也不断增加，当达到10.000mg/mL时，其抑制活性不再增加。同法得出其IC50=2.850mg/mL。

3 结论

(1)热水浸提海藻多糖操作简便快速，所用试剂易得且成本低，多糖提取率为7.8%。

(2)与多糖浓度为12mg/mL时对淀粉酶的抑制率相比较，水提多糖的抑制率为59.38%， IC50为2.850mg/mL。

参考文献：

[1]王珏，许晓曦，王红.海藻多糖防辐射机制研究进展[J].食品工业科技，2011(5):418-421.

[2]寿佩勤.部分海藻多糖的抗肿瘤作用研究和临床应用[J]．现代实用医学，2004，l6(7)：432-434.

[3]黄朋纳，黄清松.海藻多糖抗氧化作用的实验研究[J].宜春学院学报，2012，34(4)：106-107.

[4]陈家童，张斌，白玉牛，等．红藻多糖抗AIDS病毒作用的体外实验研究[J].南开大学学报:自然科学版，1998，31(4)：21.

[5]徐莉，希雨．几种传统药物的降糖活性和降糖机理[J]．国外医学：植物药分册，1996，11(4)：166-168.

[6]李宪璀,范晓,韩丽君，等.海藻提取物中α-葡萄糖苷酶抑制剂的初步筛选[J].中国海洋药物，2002(2)：8-11.