3-MA通过抑制自噬反应提高结肠癌5-FU的化疗效果

侯 妮，刘 娜，韩 佳，李 杰

(西安交通大学：1. 医学部细胞生物学与遗传学系，陕西西安 710061；2. 第二附属医院普通外科，陕西西安 710004)



3-MA通过抑制自噬反应提高结肠癌5-FU的化疗效果

侯 妮1，刘 娜1，韩 佳1，李 杰2

(西安交通大学：1. 医学部细胞生物学与遗传学系，陕西西安 710061；2. 第二附属医院普通外科，陕西西安 710004)

目的 探索新的联合化疗方案以提高5-FU为基础的结肠癌化疗效果。方法 研究5-FU(7.5 μmol/L)、3-MA(5 mmol/L)以及两种药物联合使用对人结肠癌细胞株HCT116的自噬及凋亡影响。MTT、Hoechst+PI染色检测细胞生长及凋亡，MDC染色观察细胞内自噬反应，Western blotting观察细胞内的凋亡及自噬相关蛋白改变。将HCT116细胞注射至裸鼠皮下建立在体肿瘤模型并进行治疗，观察肿瘤生长情况。结果 MTT检测结果显示HCT116在5-FU作用下细胞生长受到抑制，Hoechst+PI染色显示5-FU联合3-MA组凋亡数量较5-FU组明显增加；Western blotting检测5-FU联合3-MA组的凋亡蛋白Caspase-3、PARP表达较5-FU组明显增高。同时，MDC染色以及自噬特异性蛋白LC3II检测发现在5-FU作用下自噬反应升高，而通过3-MA抑制5-FU引起的细胞自噬反应，细胞生长抑制率从5-FU单独作用的(51.64±4.04)%提高至(79.89±1.35)%，凋亡增加超过100%。皮下注射HCT116细胞的裸鼠肿瘤模型，5-FU联合3-MA组较单独使用5-FU组有效抑制肿瘤生长，肿瘤体积及质量均明显减少。结论 3-MA可抑制5-FU处理引起的细胞自噬反应，促进细胞凋亡，HCT116细胞生长抑制率明显增加；为提高5-FU为基础的结肠癌化疗提供新思路。

结直肠癌；5-FU；3-MA；凋亡；自噬；化疗；Caspase-3；PARP；LC3

结直肠癌是一种严重威胁人类健康的疾病，发病率居各种恶性肿瘤第2位，致死率居第3位。发展中国家近年来的结直肠癌发病率明显升高，且趋于年轻化[1]。目前手术切除是结直肠癌的主要治疗方法，但对于中晚期患者，需要化疗来缓解症状以延长生命[2]。上世纪80年代，5-FU已用于结直肠癌的化疗，至1999年5-FU/leucovorin的治疗方案成为结直肠癌化疗的金指标，2000年以后奥沙利铂、依立替康等药物联合5-FU化疗方案也应用于临床治疗中[3]。但是，疗效始终有限，需要探索和研究以提高结直肠癌对5-FU化疗的敏感性。

自噬是细胞内的一种降解途径，通过降解衰老受伤的细胞器及一些大分子蛋白质来维持细胞内环境的稳定[4]。近年来多项研究发现，自噬与恶性肿瘤、遗传性肌病及神经变性性疾病等多种疾病有关。其中，自噬与肿瘤发生、发展及治疗的关系正成为研究的焦点。大量的研究发现，自噬可以导致肿瘤细胞发生自噬性死亡，提高肿瘤化疗效果。但同时也有研究发现自噬可以帮助肿瘤细胞耐受或阻止化疗药物毒性所引起的细胞破坏。因此，解析自噬与肿瘤之间的复杂关系，有利于肿瘤治疗新靶点的探索[5]。本研究观察5-FU单用或联用自噬抑制剂3-MA对人结肠癌细胞HCT116生长、凋亡的影响及自噬反应激活情况，并进一步进行在体实验验证。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和抗体

5-FU(5-fluorouracil)和3-MA(3-methyladenine)均购于美国Sigma公司。3-MA被用作自噬抑制剂，30 mg溶解于1mL dH2O中配制成200 mmol/L并室温保存。MDC(monodansylcadaverine)是一种荧光染料，被用作自噬活性变化的示踪剂，购于美国Sigma公司。抗Caspase-3、PARP抗体均购于美国Cell Signaling Technologies公司，LC3抗体为日本MBL公司，β-actin抗体为美国Sigma公司提供。

1.2 细胞培养

人结肠癌细胞株HCT116由西安交通大学医学部细胞生物学与遗传学系提供。HCT116细胞常规培养于含有100 mL/L胎牛血清并添加100 IU/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的RPMI 1640培养基(美国Hyclone公司)，并置于37 ℃二氧化碳培养箱中贴壁培养，2 d更换1次培养液。

1.3 MTT法检测细胞生长抑制率及实验分组

HCT116细胞种于96孔培养板中，每孔细胞数为4×103。HCT116在不同浓度(1.0、2.5、5.0、7.5、10.0 μmol/L)5-FU作用48 h后，每孔内加入MTT溶液(50 μg/mL)，继续置于培养箱中孵育4 h后，移除培养液，每孔内加入150 μL DMSO并振荡10 min，酶联免疫检测仪测490 nm波长处每孔吸光度值(A)，进而计算细胞生长抑制率。抑制率=1-(试验组A/对照组A)×100%，结果表示为平均抑制率±标准差。

实验分组根据1.3实验结果选取适宜的5-FU浓度，取对数生长期细胞分成4组进行治疗干预实验，分别为对照组(无药物处理)、3-MA组(5 mmol/L 3-MA处理)、5-FU组(7.5 μmol/L 5-FU处理)及3-MA联合5-FU治疗组(7.5 μmol/L 5-FU与5 mmol/L 3-MA共同处理)，分别干预48 h。每组设5个复孔。MTT法检测细胞生长抑制率情况。

1.4 MDC染色检测各干预组细胞内自噬情况

自噬改变通过MDC染料检测，MDC可标注自噬泡，并通过荧光显微镜进行观察。4组细胞干预48 h，加入0.05 mmol/L MDC在37 ℃孵育10 min后，置于荧光显微镜(ECLIPSE TE2000-U, Nikon)下，在380 nm激发波下进行观察并采集图像。

1.5 Western blotting检测自噬及凋亡相关蛋白的表达

分别收集4组细胞于细胞裂解液[20 mmol/L Tris-HCl pH 7.6，1 mmol/L EDTA，140 mmol/L NaCl，NP-40，1% aprotinin, 1 mmol/L phenylemethylsulfonyl fluoride(PMSF)，1 mmol/L sodium vanadate]中裂解。通过BCA Protein Assay kit (Pierce)进行蛋白质浓度定量。取20 μg蛋白质经SDS-PAGE凝胶电泳分离后，转至PVDF膜，充分干燥。50 g/L脱脂牛奶封闭1 h，依次给以一抗(LC3、Caspase-3或PARP抗体，稀释比均为1∶1 000)、连接辣根过氧化物酶的二抗孵育(稀释度为1∶5 000)后，ECL(Millpore)发光，扫描仪扫描并保存图像。

1.6 Hoechst+PI染色

DNA结合染料Hoechst 33342(10 μmol/L)和PI(10 μmol/L)标记凋亡细胞，380 nm激发波荧光显微镜下进行观察。凋亡细胞可观察到破碎的凋亡小体呈蓝色或红色荧光。而正常存活细胞或坏死细胞，仍显示出完整的细胞核呈蓝色或红色。最少观察4个视野不少于500个细胞，并计算细胞凋亡率。

1.7 建立动物模型及实验

皮下注射HCT116细胞悬液于裸鼠右胁部。当肿瘤体积达预定值(180～350 mm3，大约在注射后10 d左右)，裸鼠被随机分成4组进行治疗干预：对照组、3-MA组、5-FU组及3-MA联合5-FU组。30 mg/kg 5-FU、24 mg/kg 3-MA分别溶于100 μL盐水中，按照预定分组注射于裸鼠腹腔内，每5 d注射1次，共计5次。对照组同时注射100 μL盐水进行对照观察。每5 d观察1次肿瘤体积，肿瘤体积通过公式V=1/2ab2(a为肿瘤最大直径，b为肿瘤最小直径)进行估算。1月后切除肿瘤新生物并拍摄照片，同时测量肿瘤体积及质量。

1.8 统计学分析

应用SPSS 13.0统计软件进行分析，所得数据采用“均数±标准差”表示，两组比较采用unpaired Student’st-test，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 3-MA可增强5-FU对HCT116的生长抑制作用

MTT检测结果显示，HCT116在不同浓度(1.0、2.5、5.0、7.5、10.0 μmol/L)5-FU作用48 h后，细胞生长受到明显抑制，具有一定的浓度依赖关系。7.5 μmol/L 5-FU作用48 h的细胞生长抑制率可达(51.64±4.04)%(图1A)。据此，7.5 μmol/L 5-FU处理HCT116细胞48 h被用于后续实验中。

MTT检测4组干预处理组细胞结果显示，5-FU、3-MA联合组HCT116细胞生长抑制率从5-FU单独作用下的(51.64±4.04)%提高至(79.89±1.35)%，而单独使用3-MA所造成的细胞抑制较对照组仅有轻微升高(图1B)。

图1 MTT法检测细胞生长抑制率的变化

Fig.1 Changes of cell survival in HCT116 treated by 5-FU or/and 3-MA
A：不同浓度5-FU作用HCT116细胞48 h；B：与单独5-FU对比，联合使用3-MA与5-FU显著提高细胞生长抑制率，**P<0.01(结果取自至少3次独立重复实验)。

2.2 3-MA可以抑制5-FU引起的HCT116自噬的激活

MDC是一种荧光染料，用于标记细胞内酸性颗粒，常被用作自噬活性改变的示踪剂。而3-MA是磷脂酰肌醇3激酶的抑制剂，进而影响自噬泡的发生，被广泛用作自噬的抑制剂[6]。MDC检测发现，5-FU组HCT116细胞质中或核周围区域光点样结构较对照组明显增加，提示5-FU在抑制细胞生长的同时，细胞内自噬反应被激活。而联合3-MA处理细胞后，光点样结构减少，提示3-MA有效抑制5-FU引起的自噬反应(图2A)。

通过LC3蛋白免疫印迹方法验证显示同样结果(图2B)，在自噬反应激活时，细胞胞质中可溶性LC3I(18 ku)与自噬泡膜表面的磷脂酰乙醇胺(PE)结合，形成LC3II(16 ku)，LC3II含量以及LC3II/LC3I的值通常用来反映细胞的自噬活性[7]。Western blotting结果中条带灰度通过软件(Gel Plotting Macros of NIH image 1.62)量化，计算LC3II/LC3I。与5-FU组对比，联合使用3-MA使得LC3II/LC3I比值明显减少(图2C)。

2.3 3-MA明显增加5-FU引起细胞凋亡及相关蛋白表达变化

Hoechst+PI染色显示，5-FU联合3-MA组凋亡数量较5-FU组明显增加，通过在高倍镜视野中计数500个以上细胞，发现5-FU联合3-MA组凋亡数量较5-Fu组中增加超过1倍(图3A)。Western blotting检测凋亡蛋白Caspase-3及PARP活性片段增多(图3B)。这提示5-FU在抑制细胞生长的同时，可导致细胞发生凋亡，而3-MA明显增加凋亡。

2.4 5-FU联合使用3-MA的在体实验显示有效抑制肿瘤生长

裸鼠皮下种植肿瘤细胞后10 d，按照预定实验方案进行分组治疗。实验全程各组裸鼠体质量及健康程度无明显差异。5-FU联合3-MA组较单独5-FU组肿瘤形成明显缓慢(图4A)；35 d后终止实验时，单独5-FU组和联合处理组的肿瘤体积分别为(1.61±0.78)cm3和(0.5±0.45)cm3；肿瘤质量分别为(0.74±0.44)g和(0.45±0.24)g。5-FU联合3-MA组裸鼠最终形成的肿瘤明显小于和轻于单独5-FU组，有效抑制肿瘤的生长(图4B和4C)。

图2 5-FU和/或3-MA作用于HCT116细胞的自噬改变

Fig.2 Changes of autophagy in HCT116 treated by 5-FU or/and 3-MA
A：各组细胞的MDC染色结果(×200)；B：Western blotting检测各组细胞中LC3蛋白的表达结果；C：LC3II/LC3I的量化结果，与5-FU组比较，*P<0.05(结果取自至少3次独立重复实验)。

图3 Hoechst+PI染色及Western blotting检测凋亡蛋白表达

Fig.3 Changes of apoptosis in HCT116 treated by 5-FU or/and 3-MA
A：各组细胞的Hoechst+PI染色结果(×200)；B：各组细胞中Caspase-3及PARP蛋白的表达结果(结果取自至少3次独立重复实验)。

图4 联合应用5-FU、3-MA明显抑制裸鼠肿瘤生长

Fig.4 Inhibition of xenograft growth by combination of 5-FU and 3-MA
A：各组肿瘤体积的改变；B：各组形成肿瘤的大体病型照片；C：各组形成肿瘤的质量比较。*P<0.05(结果取自至少3次独立重复实验)。

3 讨 论

结直肠癌是一种严重威胁人类健康的恶性肿瘤疾病，化疗能够有效地减少肿瘤的复发并延长患者生命。然而越来越多抗药性的产生严重影响到结直肠癌的治疗效果，急需研究新的化疗方法。本研究通过体外及在体实验发现，5-FU抑制结直肠癌细胞的生长，并可导致细胞凋亡，同时细胞内自噬反应被激活；通过自噬抑制剂3-MA抑制自噬反应，细胞凋亡明显增加，裸鼠皮下种植肿瘤体积大幅度缩小，提高了5-FU结直肠癌化疗效果。

已发现自噬与肿瘤有着密切联系。如在肿瘤早期，自噬能够损伤肿瘤细胞而抑制肿瘤的发生；在进展期，自噬又似乎促进肿瘤的发展，肿瘤中心区的细胞可以通过自噬反应来耐受低氧及低营养的环境。特别是在肿瘤化疗过程中，自噬能够通过隔离并降解被药物破坏的蛋白或细胞器，而保护细胞并对抗化疗药物，降低化疗药物疗效[8]。

3-MA是一种经典的自噬抑制剂，近来有许多研究发现，3-MA能够有效地联合化疗药物促进肿瘤细胞发生凋亡。如HERMAN-ANTOSIEWICZ等[9]的研究发现，在人前列腺癌细胞中，3-MA可以通过促进细胞色素C在细胞质中的释放而促进sulforaphane导致的PC-3细胞凋亡。而在乳腺癌MCF-7细胞中，3-MA同样可以增加100 g/L喜树碱所导致的细胞死亡[10]。本实验也同样发现，在5-FU作用下，人结肠癌细胞中自噬反应增加，通过3-MA抑制后，细胞凋亡增加1倍以上。自噬对细胞的作用具有两面性：既可以作为细胞生长的“朋友”，也可能成为“敌人”，这取决于疾病进展的不同阶段、细胞周围环境的变化和治疗干预措施的不同。因此，更深入地研究5-FU导致细胞内自噬反应发生的机制及自噬与凋亡间的联系，自噬与肿瘤之间的联系等，并将对自噬的干预用于肿瘤治疗中，将是今后的研究重点并成为肿瘤治疗的新亮点。

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(编辑 国 荣)

3-MA enhances chemotherapeutic effect of 5-FU by inhibiting autophagy in colon cancer

HOU Ni1, LIU Na1, HAN Jia1, LI Jie2

(1. Department of Cell Biology and Genetics, Xi’an Jiaotong University Health Science Center, Xi’an 710061; 2. Department of General Surgery, the Second Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University, Xi’an 710004, China)

Objective To explore a novel adjuvant strategy of improving 5-fluorouracil (5-FU)-based chemotherapy for colorectal cancer. Methods Human colon cancer cell (HCT 116) was used to investigate the effect of 5-FU (7.5 μmol/L), 3-methyladenine (3-MA, 5 mmol/L), or their combination on apoptotic cell death and autophagy. MTT assay was used to observe the suppression of cell survival. Hoechst plus PI staining and MDC assay was used to detect apoptosis and autophagy. Western blotting was used to explore the molecular changes. Finally, the experiment results were further examinedinvivo. Results We found that the survival of HCT116 was suppressed by 5-FU and the combination of 5-FU and 3-MA promoted the apoptosis. Autophagy was activated by 5-FU treatment and 3-MA inhibited 5-FU-induced autophagy. The suppression of cell survival increased from (51.64±4.04)% to (79.89±1.35)%, and the apoptosis increased by more than 100%. HCT116 cells were injected in the nude mouse to produce tumor. The combination treatment of 5-FU and 3-MA inhibited the growth of xenografts compared with 5-FU alone. Conclusion 3-MA enhances 5-FU-induced apoptosis by inhibiting autophagy in HCT116, and this could be a promising strategy for colorectal cancer chemotherapy.

colorectal cancer; 5-FU; 3-MA; apoptosis; autophagy; chemotherapy; Caspase-3; PARP; LC3

2015-05-05

2015-10-13

国家自然科学基金资助项目(No.81172358) Supported by the National Natural Science Foundation of China (No.81172358)

李杰. E-mail: lijie_0531@163.com

R73-36; R735.3

A

10.7652/jdyxb201601009

优先出版：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20151209.1503.002.html(2015-12-09)