高迁移率族蛋白N2免疫组织化学定位及其活性结构抑菌性能的体外实验研究

刘　奕　周荣静　费　伟

1.四川省医学科学院•四川省人民医院口腔科 成都 610072；2.山东省聊城市人民医院口腔科 聊城 252000

高迁移率族蛋白N2免疫组织化学定位及其活性结构抑菌性能的体外实验研究

刘奕1周荣静2费伟1

1.四川省医学科学院•四川省人民医院口腔科 成都 610072；2.山东省聊城市人民医院口腔科 聊城 252000

目的 研究高迁移率族蛋白N2（HMGN2）在猪组织中的免疫组织化学定位情况，体外评价HMGN2的活性结构α-螺旋的抑菌性能。方法 采用免疫组织化学法，观察HMGN2蛋白在猪组织中的表达；采用高效液相色谱法从猪的胸腺和淋巴结中分离和纯化HMGN2，人工合成HMGN2的活性结构α-螺旋，采用液体稀释法体外评价HMGN2及HMGN2 α-螺旋结构对变异链球菌、表兄链球菌、白假丝酵母菌及大肠杆菌的抑菌性能。结果 从猪的胸腺和淋巴结中成功分离和纯化得到HMGN2，所有受检猪组织均呈HMGN2免疫阳性反应，且HMGN2多表达在组织细胞质和细胞核中；HMGN2和HMGN2 α-螺旋结构抑菌活性相当，均对所选实验菌株均表现出不同的抑菌性能。结论 HMGN2可表达在猪组织的细胞浆和细胞核中，HMGN2及其活性结构α-螺旋具有较强的抑菌性能。

高迁移率族蛋白N2； 免疫组织化学； 抑菌性能

口腔疾病是较为常见的疾病，是危害人类健康的主要疾病之一。抗菌肽是生物体内一类可诱导产生、分子量小、热稳定性强、具有广谱抗菌活性的可溶性多肽。高迁移率族蛋白N2（high mobility group protein N2，HMGN2）是高迁移率族蛋白家族成员，是一类普遍存在于高等真核细胞的细胞核内，具有双亲性α-螺旋结构的新型抗菌肽。HMGN2由90个氨基酸残基组成，是一组与核小体结合的核蛋白，表达于细胞核和细胞质，其抗菌活性主要集中在α-螺旋结构区域[1]。本研究旨在研究新型抗菌肽HMGN2在猪组织中的免疫组织化学定位情况，体外评价HMGN2及其活性结构α-螺旋的抑菌性能，为进一步研究HMGN2 α-螺旋结构调节口腔生态环境的作用机制奠定基础。

1　材料和方法

1.1实验主要仪器和设备

光学显微镜（Nikon公司，日本），厌氧培养箱DY-2（浙江义乌冷冻机总厂），CrystalSpecTM比浊仪（Becton Dickinson公司，美国），针孔式滤膜过滤器（孔径为0.2 μm，无锡赛维商贸），兔抗人HMGN2多克隆抗体（口腔疾病研究国家重点实验室冯云教授惠赠），免疫组织化学试剂盒（北京中杉生物技术有限公司）。

1.2组织标本

选取6～8月龄猪处死，迅速摘取其新鲜组织：肝、胸腺、肾、心、肺和淋巴结，10%（体积分数）中性甲醛溶液固定，石蜡包埋，连续切片5 μm，保存备用。

1.3实验菌株及培养

变异链球菌（ATCC25175）、表兄链球菌（6715）、白假丝酵母菌（ATCC10691）、大肠杆菌（ATCC25922）的实验菌株由口腔疾病研究国家重点实验室提供。其中，变异链球菌和表兄链球菌在TPY琼脂培养基中培养，白假丝酵母菌，大肠杆菌在普通血琼脂培养基（BA培养基中）培养。

1.4 实验方法及步骤

1.4.1免疫组织化学法主要步骤 本实验采用免疫组织化学链霉菌抗生素蛋白-过氧化物酶连接法，将制备好的石蜡切片常规脱蜡至水，3%过氧化氢溶液作用20 min以消除内源性过氧化物酶活性，0.01 mol·L-1pH6.0枸橼酸盐缓冲液高压热修复法抗原修复，滴加1∶100稀释的兔抗人HMGN2多克隆抗体50 μL湿盒内4 ℃过夜，次日室温下复温1 h，滴加生物素化的羊抗兔二抗50 μL室温孵育1 h，再滴加辣根过氧化物酶标记的链霉素卵白素50 μL室温孵育1 h；新鲜配制0.04%DAB显色1～5 min，镜下控制反应时间；苏木素复染，脱水，中性树胶封片。用磷酸盐缓冲液代替一抗作为空白对照。HMGN2的染色结果由2名病理科医生采用双盲法镜检，细胞核，细胞质出现棕黄色或黄色者为阳性细胞，未出现棕黄色或黄色者为阴性细胞。

1.4.2HMGN2的分离提取 按文献[2]报道的方法进行，首先取新鲜猪胸腺和淋巴结，剔除表面筋膜和血管组织，切成小块速冻于液氮中，碾碎成细粉末状，在5%的乙酸中电动匀浆，离心收集上清，收集的上清液移入分子截流量为3.5×103的透析袋中，4 ℃透析48 h除去乙酸，冷冻干燥后，得到酸溶性粗提物，-70 ℃保存备用。0.1%的乙酸溶解重悬后，4℃，12 000 r·min-1，离心10 min，收集上清液，用于反相高效液相色谱法（reverse phase high-performance liquid chromatography，RP-HPLC）分离。RP-HPLC分离条件：0.1%三氟乙酸/60%乙氰0～60 m线形梯度洗脱，检测波长214 nm，流速1 mL·min-1。样本收集：收集洗脱液每管1 mL。真空冷冻干燥后，再溶于0.1%乙酸中，进行三羟甲基甘氨酸-十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacry-lamide gel electrophoresis, Tricine-SDS-PAGE），将电泳装置与电源相接，100 V 电泳1 h 左右，至染料条带进入分离胶后电压改为80 V，继续电泳4 h，关闭电源。最后对提取的HMGN2 分子进行质谱精确分子量测定，质谱分析由北京赛百盛基因技术有限公司。

1.4.3人工合成HMGN2 α-螺旋结构域 HMGN2的α-螺旋结构：KDEPQRRSARLSAKPAPPKPEPKP KKAPAKK（position 18-48 of HMGN2 amino acid sequence)，由北京赛百盛基因技术有限公司合成并进行质谱鉴定，合成后相对分子质量为3 433。

1.4.4实验用液和菌悬液的制备 取制备好的HMGN2和人工合成的HMGN2 α-螺旋结构，用灭菌双蒸水配制蛋白溶液，针孔滤器过滤，-20 ℃保存备用。实验菌种接种于相应固体培养基上复苏，于80%N2、10%H2、10%CO2，37 ℃下厌氧培养24～48 h，白假丝酵母菌于恒温培养箱37 ℃需氧培养24 h。检查菌落生长形态，镜检无污染，涂片检查证实为纯培养后，挑取单个菌落于液体培养基中在相同培养条件下培养增菌，CrystalSpecTM比浊仪测定菌悬液浓度，磷酸缓冲液配制的菌悬液浓度为1×106CFU·mL-1。

1.4.5最小抑菌浓度（minimum inhibitory concen-tration，MIC）及最小杀菌浓度（minimum bactericidal concentration，MBC）的测定 实验分为3个组：分别含HMGN2和HMGN2 α-螺旋结构实验液和菌悬液的液体培养基（实验组），含氯已定和菌悬液的液体培养基（阳性对照组），含磷酸缓冲液和菌悬液的液体培养基（阴性对照组），每组设置3个平行组。分别将HMGN2和HMGN2 α-螺旋结构实验用液按2倍稀释法分别配制成浓度为500、250、125、62.5、31.25、15.68、7.8、3.9 μg·mL-1溶于液体培养基中。细菌悬液与各组药液按体积比例，各100 μL分别接种于无菌96孔板中，用微量振荡器振荡1 min后，置于适当的培养环境中培养24 h。在黑色背景下，凡肉眼观察微孔内液体清亮无浑浊或沉淀生长的最低药物浓度为MIC值。选择大于MIC浓度的各孔，分别取20 μL划线接种于固体培养基上，相同条件下培养，观察菌落数少于5～6个的最低浓度为MBC值。所有菌种的MIC测定实验重复3次。

2　结果

2.1HMGN2蛋白在猪的肝、胸腺、肾、心、肺和淋巴结中的免疫组织化学定位情况

图1分别显示了HMGN2在猪的肝、胸腺、肾、心、肺和淋巴结中的免疫组织化学定位情况。结果显示：所有受检组织均呈HMGN2免疫阳性反应，且HMGN2多表达在组织细胞质和细胞核中。每一种组织的阳性反应强度不同，胸腺、肾脏和淋巴结组织中可观察到HMGN2强免疫反应，肝、心、肺免疫反应较弱。

图1　HMGN2在猪的肝、胸腺、肾、心、肺和淋巴结中的免疫组织化学定位情况Fig 1 Immunohistochemical localization of HMGN2 protein in porcine liver, thymus, kidney, heart, lung, and lymph node

2.2HMGN2的鉴定

从猪胸腺和淋巴结中分离纯化的HMGN2蛋白，经Tricine-SDS-PAGE分析显示其纯度较高，表观相对分子质量约为14 000，此蛋白即为目标蛋白HMGN 2分子。质谱分析显示，HMGN2的相对分子质量为9 274，与文献[2]报道一致。

2.3抑菌性能检测结果

HMGN2和HMGN2 α-螺旋结构域对口腔变异链球菌，表兄链球菌及大肠杆菌的MIC和MBC结果如表1所示，表明HMGN2和HMGN2 α-螺旋结构域抗菌活性相当，均对口腔主要致病菌及大肠杆菌有明显的抑菌效果。

表1　HMGN2和HMGN2 α-螺旋结构域对口腔疾病主要致病菌的MIC及MBC值Tab 1 MIC and MBC of HMGN2 and α-helical domain of HMGN2 against oral pathogenic bacteria μg·mL-1

3　讨论

HMG蛋白是脊椎动物和非脊椎动物的细胞核中含量最为丰富的非组蛋白家族，普遍存在于高等真核生物中。HMGN2属于HMGN亚家族，相对分子质量约为9 200，共由90个氨基酸残基组成，为碱性蛋白质。HMGN2的编码基因属于一个多基因家族，通过基因杂交方法发现HMGM2多基因家族中功能基因仅有一个，定位于染色体1P36.1[3-4]。HMGN2是不含二硫键结构的线形分子，由外显子3和外显子4编码的17～47位30个氨基酸组成的核小体结合区，为强阳离子区，具有核小体结合功能，将HMGN2锚定在染色体上，经分析其为α-螺旋区，具有跨膜功能[5]。

研究表明HMGN2在组织中的表达有一定的特异性：HMGN2 mRNA在人前列腺、垂体、甲状腺、胸腺、骨髓和胎儿的脾、肝、肺、胸腺中水平较高，其余组织中水平均为中等[6-7]。Amen等[8]发现HMGN2还可表达在牙齿和胚胎14.5 d磨牙牙蕾的口腔上皮中，其表达受到胚胎组织的限制，在成熟组织中HMGN2表达下降。由于HMGN2有很高的保守性，早期的研究常从牛胸腺或鸡红细胞中提取，使HMG各蛋白得到很好的分离，这样的提取方法具有来源丰富，具有天然结构的优点，但不足之处是这并不是人的HMGN2。后来，人们又试着从人肿瘤细胞株中提取，甚至用分子克隆的方法经诱导表达得HMGN2蛋白，但这种技术获得的HMGN2无真核细胞蛋白编码后的修饰。Boumba等[9]从猪胸腺中成功提取了HMGN2，并对其进行了序列分析，发现其结构与来源于人类的同类家族蛋白相似性最高，仅仅是在64位上发生了一个保守置换，即天门东氨酸替代了谷氨酸。近年来，也有学者成功地从人单核细胞系THP-1细胞中分离纯化出了HMGN2抗菌肽。

在本研究的免疫组织化学定位实验中，检测发现HMGN2在猪的肝、胸腺、肾、心、肺和淋巴结中均呈HMGN2免疫阳性反应，HMGN2表达在组织细胞浆和细胞核中。每一种组织的阳性反应强度不同，提示除了从猪胸腺组织中可获取HMGN2，还可从猪肾脏和淋巴结中提取HMGN2，也说明HMGN2作为一个免疫活性分子可能参与了体内的天然免疫防御作用。

由于天然抗菌肽生物效能低，具有蛋白水解的不稳定性，这两个特点极大的阻碍了它们的临床应用。根据对抗菌肽作用的共同特征的分析，对抗菌肽的分子序列、所带电荷性、螺旋性结构、疏水性、亲水亲脂性等进行结构改造有助于提高其抗菌活性。本实验所得到的HMGN2的多肽结构域α-螺旋即是采用人工固相多肽合成的方法而得到。该方法将肽链结合到一种具反应活性位点的聚合物（固相支持物，不溶于水和有机溶剂的树脂支持物）上，解决了以前多肽合成中分离和纯化效率低的难题。Feng等[10]分别构建了HMGN2以及HMGN2 α-螺旋结构域重组表达质粒，发现HMGN2有抗大肠杆菌、铜绿假单胞菌等的活性，且HMGN2和HMGN2 α-螺旋区域的抗菌活性相当。有学者发现HMGN2除可影响上皮细胞，也可能对细菌本身产生一定作用，共同减弱细菌内化，此外，还发现HMGN2可以抑制口腔鳞状细胞癌的生长[11]。

本研究进一步采用液体稀释法测定了HMGN2和HMGN2 α-螺旋结构域对实验菌株的MIC及MBC值，实验结果显示HMGN2和HMGN2 α-螺旋结构抗菌活性相当，这与以往学者研究结果一致。HMGN2和HMGN2 α-螺旋结构域对口腔疾病常见致病菌有抑制作用，提示抗菌肽HMGN2可能作为一种天然免疫介质参与机体对细菌的抵抗过程，至于HMGN2分子如何动态地在各组织细胞内发挥生物学作用，还需要进一步研究。

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（本文编辑 骆筱秋）

Immunohistochemical localization and antimicrobial properties of high mobility group protein N2

Liu Yi1, Zhou Rongjing2, Fei Wei1.
(1. Dept. of Oral Medicine, Sichuan Academy of Medical Sciences & Sichuan Provincial People's Hospital, Chengdu 610072, China; 2. Dept. of Oral Medicine, Liaocheng People's Hospital, Liaocheng 252000, China)

This study was supported by Doctoral Fund of Sichuan Provincial People's Hospital(30305030568).

Objective To study immunohistochemical localization of high mobility group protein N2(HMGN2) protein in porcine tissues, and evaluate the antimicrobial activity of its active domain, α-helical domain in vitro. Methods In this study, we investigated the localization of HMGN2 protein in porcine tissues using the immunohistochemical method. In addition, we isolated and purified HMGN2 from porcine thymus and lymph node by the high-performance liquid chromatography(HPLC), and then we synthesized α-helical domain of HMGN2. After that, we evaluated the antimicrobial activity of HMGN2 and α-helical domain of HMGN2, against Streptococcus mutans, Streptococcus sobrinus, Candida albicans and Escherichia coli in vitro. Results The results showed that HMGN2 could be isolated and purified from porcine thymus and lymph node, and all the tested porcine tissues were immunoreactive to HMGN2 proteins. The proteins mostly presented in the cytoplasm and nucleus. Synthetic α-helical domain of HMGN2 and HMGN2 had equivalent antibacterial activity, and both of them had potent antimicrobial activity against the selected bacteria and fungi. Conclusion The study suggested that the HMGN2 proteins mostly presented in the cytoplasm and nucleus in porcine tissues, and HMGN2 and synthetic α-helical domain of HMGN2 had potent antimicrobial activity against some bacteria and fungi.

high mobility group protein N2； im-munohistochemistry； antibacterial activity

R 782

A [doi] 10.7518/gjkq.2016.06.010

2016-01-23；

2016-05-21

四川省人民医院博士基金（30305030568）

刘奕，副主任医师，博士，Email：liuyi82404@hotmail.com

费伟，主任医师，博士，Email：fwross10@foxmail.com