禽IL-2单克隆抗体的制备与鉴定

付梦姣 ， 王永强 ， 曹 红 ， 李晓齐 ， 郑世军

(中国农业大学动物医学院农业生物技术国家重点实验室 ， 北京海淀100193)

禽IL-2单克隆抗体的制备与鉴定

付梦姣 ， 王永强 ， 曹 红 ， 李晓齐 ， 郑世军

(中国农业大学动物医学院农业生物技术国家重点实验室 ， 北京海淀100193)

为制备禽源IL-2的单克隆抗体，首先构建chIL-2的原核表达载体并进行表达，用HIS-IL-2蛋白免疫BALB/c小鼠，经3次免疫后，取小鼠脾与骨髓瘤细胞sp2/0 融合，应用间接ELISA 方法筛选阳性杂交瘤，最终获得3 株稳定分泌chIL-2 抗体的杂交瘤，分别命名为1C2，2F2和4B5。并对所获得单抗的特性进行了鉴定，结果表明，3株单抗亚型均为IgG1，抗体亲和力解离常数(Kd)分别为4.81×10-10、1.36×10-10、4.15×10-9，均为高亲和力抗体，经过Western Blot 确定3株单抗分别识别chIL-2的不同区域，且均能特异性识别chIL-2。该单抗的制备为chIL-2的功能研究和应用奠定了基础。

禽源IL-2 ； 原核表达 ； 单克隆抗体

IL-2(Interleukin-2)主要是由T细胞产生的具有重要免疫调节作用的细胞因子。1976 年Morgan 等[1]发现小鼠脾细胞培养上清液中有一种能够促进和维持T 细胞在体外长期生长的因子，将其称为T 细胞生长因子(T cell growth factor，TCGF)，1979 年统一命名为IL-2，1983 年Taniguchi等[2]从ConA 刺激的Jurkat T 细胞系中首次成功克隆出人IL-2 基因并成功表达，此后多种哺乳动物及反刍动物的IL-2 基因被相继成功克隆出来[3]。1997 年，Sundick 等[4]用ConA 激活的鸡脾淋巴细胞构建了一个cDNA 文库，获得了鸡IL-2 基因。Hilton 等[5]的研究表明，作为第一个非哺乳动物IL-2 基因克隆，鸡IL-2 表现了与哺乳动物相似的生物学活性。由于鸡IL-2 与哺乳动物的IL-2差异较大，且具有很强的种属特异性[6-7]，使许多可在哺乳动物中成功应用的技术和方法都无法有效地应用于鸡IL-2 的研究，本研究通过制备鸡IL-2单克隆抗体，为深入研究鸡IL-2的生物学功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 菌种、质粒、蛋白、细胞及实验动物 大肠杆菌E.coliBL21、Rosetta、DH5α，骨髓瘤细胞sp2/0，质粒pGEX-6p-1、pET-28a 为本实验室保存，标签蛋白His-IL-10、His-IFN-γ、His-IFN-β为本实验室保存。BALB/c 小鼠，购自中国医学科学院实验动物研究所。

1.2 主要试剂与仪器设备 限制性内切酶、LATaq酶和DNA 连接酶，购自TaKaRa 公司。dNTPs，购自CNS 公司；DNA 胶回收试剂盒，购自ZYMO RESEARCH 公司；高纯度质粒小量快速提取试剂盒，购自北京艾德莱公司；Ni-NTA 亲和纯化柱，购自德国Qiagen 公司；Glutathione Sephrose 4B 凝胶，购自GE Healthcare BioSciences AB 公司；鼠源His-tag与GST-tag 单克隆抗体，购自Abmart 公司；HRP 标记山羊抗小鼠IgG 二抗，购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；DMEM高糖培养基，购自Gibco公司；标准胎牛血清，购自Hyclone 公司；弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、HAT、HT 和鼠单抗亚型分型试剂，均购自Sigma 公司。PEG 4000，购自MERCK 公司；Centrifuge5810R 型低温冷冻高速离心机，购自Eppendorf 公司；Alpha ImagerTM2200 型凝胶成像分析仪，购自美国Alpha 公司；KoDak 医学X 光显影机102 型，购自美国KoDak 公司；Sunrise型96 孔酶标仪，购自TECAN 公司。

1.3 chIL-2 原核表达载体构建及蛋白纯化 取感染球虫的鸡脾淋巴细胞，提取其总mRNA 进行反转录，以反转得到的cDNA 为模板，根据NCBI上发布的禽源IL-2 的序列(NO.AM231331.1)设计引物：F,5′-ATGATGTGCAAAGTACTGATCTTT-3′；R,5′-TTATTTTTGCAGATATCTCAC-3′，将扩增得到的特异性条带回收后连接至T 载体，转化至DH5α，以测序正确的载体为模板，用含有酶切位点BamHI 和EcoRI 的特异性引物(F,5′-CGCGGATCCATGATGTGCAAAGTACTGATCTTT-3′；R,5′-CCGGAATTCTTATTTTTGCAGATATATAAC-3′)将chIL-2 扩增出来，双酶切后连接到酶切过的pET-28a 和pGEX-6p-1 载体上，转化入DH5α，通过菌落PCR 检测并将双酶切鉴定的阳性样本进行测序，测序正确者即载体构建成功。

将构建成功的质粒pET-28a-chIL-2与pGEX-6p-1-chIL-2分别转化工程菌，进行诱导表达。通过SDS-PAGE分析蛋白表达情况并用Western Blot进行验证。确定蛋白表达之后进行大量诱导表达，通过包涵体复性或亲和层析的方法对所获得蛋白进行纯化，纯化后的蛋白分别用作免疫小鼠和阳性杂交瘤筛选抗原。

1.4 chIL-2单克隆抗体的制备 小鼠经过3次免疫后，以ELISA方法测定chIL-2阳性血清效价，效价合格者用于细胞融合。小鼠免疫程序参照文献[8]进行，细胞融合、阳性杂交瘤筛选参照文献[9]。腹水的制备及单抗的纯化按照文献[10]所述方法进行。

1.5 chIL-2单克隆抗体的鉴定

1.5.1 单体Ig 亚类鉴定 单抗亚类的鉴定按照Sigma 公司的鼠单抗亚型分型试剂鉴定试剂盒说明书进行。

1.5.2 单抗亲和力的测定 应用间接ELISA 法，以1 μg/mL 的浓度用GST-chIL-2 包被酶标板，封闭后加入倍比稀释的纯化单抗进行孵育，以HRP标记的山羊抗小鼠IgG 为二抗，酶标仪读取OD450nm 吸光值。连续几个稀释度的OD450nm 读数不再增大时视为抗原抗体100%结合，以抗体浓度(mol/L)为横坐标，OD450nm 吸光值为纵坐标做散点图，以读数最大值一半时抗原抗体结合率为50%，生成对数趋势线和公式。将OD450nm 最大值的一半代入公式，求出此时的抗体浓度即为亲和力解离常数(Kd)。

1.5.3 单抗腹水效价测定 制备前1 周，按照500 μL/只向小鼠腹腔内注射石蜡，杂交瘤扩大培养后，每只小鼠按照106个细胞数腹腔注射200 μL 杂交瘤细胞悬液，6 d 后，小鼠腹围明显增大，采集腹水，用间接ELISA法测定腹水效价。

1.5.4 单抗特异性鉴定 分别用原核表达的His-chIL-2、His-chIL-10、His-chIFN-γ 以及His-chIFN-β进行单抗特异性的鉴定，将不同蛋白稀释一定倍数后进行Western Blot，分别用稀释的单抗(1∶5 000)或His 单抗(1∶10 000)作为一抗，检测所得单抗对常见的不同细胞因子的交叉反应。

1.5.5 Western Blot分析单抗识别抗原表位 ChIL-2 全长132 个氨基酸，其N 端有一段大小为11 个氨基酸的信号肽区域[11]，故首先构建了带有HIS 标签的成熟的chIL-2，共121 个氨基酸，然后分别从其C 端和N 端以40 个氨基酸为单位进行截短，命名为Δ1、Δ2。用稀释的单抗作为一抗进行Western Blot检测，确定各株单抗的识别区域。

2 结果

2.1 原核表达载体构建及蛋白纯化 从鸡的脾淋巴细胞中成功克隆出432 bp 大小的chIL-2 基因，与预期一致(见图1A)。经BamHI、EcoRI 双酶切验证成功(见图1B-C)，构建出pET-28a-chIL-2、pGEX-6p-1-chIL-2 重组质粒，转入工程菌后成功表达出目的蛋白。分别利用包涵体复兴及亲和层析的方法对目的蛋白进行纯化，均获得较好的纯化效果(见图1D-E)。

2.2 chIL-2 单克隆抗体的制备 经3 次免疫后，小鼠血清中chIL-2 抗体效价达到1∶128 000。细胞融合后利用间接ELISA方法对融合后细胞上清中chIL-2抗体进行检测，共筛到6株阳性杂交瘤，经过3 次亚克和扩繁最终获得3 株可稳定分泌chIL-2抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为1C2，2F2，4B5。杂交瘤细胞注射小鼠腹腔进行腹水制备，经测定，3株单克隆抗体腹水的效价分别为：1C2：5.12×107，2F2:6.4×106,4B5:1.28×107。并将腹水纯化获得纯化单抗。

图1 重组表达载体的构建及融合蛋白的纯化

A：chIL-2基因的克隆； B、C：重组表达载体pET-28a-chIL-2、pGEX-6p-1-chIL-2的双酶切验证；D、E：目的蛋白His-chIL-2、GST-chIL-2的纯化

2.3 单克隆抗体性质的鉴定

2.3.1 单抗亚类的确定 根据抗体检测试剂盒单抗亚类检测方法，确定出3 株单抗的亚型均为IgG1。

2.3.2 单抗的纯化及亲和力测定 利用饱和硫酸铵法对所得腹水进行纯化，对纯化后的单抗进行亲和力测定，3 株杂交瘤分泌的单抗亲和力解离常数(Kd)分别为4.81×10-10(1C2)、1.36×10-10(2F2)以及4.15×10-9(4B5)，均为高亲和力抗体(见图2A～C)。

2.3.3 单抗识别抗原表位分析及特异性鉴定 经Western Blot 验证3 株单抗分别识别的区域，单抗1C2 识别chIL-2 的1～40 位氨基酸，2F2 识别chIL-2 的81～121 位氨基酸，4B5 识别chIL-2 的41～80 位氨基酸(见图3A-C)。即共获得3 株分别识别不同位点的单抗。并且3株单抗均不能识别HIS 标签的其他细胞因子，表现出良好的特异性(见图3D)。

3 讨论

IL-2 是免疫应答所必需的细胞因子，在T 细胞生长和分化、B细胞发育及NK细胞激活方面发挥重要的作用[12-13]。目前，许多的病原感染畜禽后会通过损害机体的免疫器官或免疫细胞造成免疫抑制或损伤。虽然对于各病原造成免疫抑制的机理尚不完全清楚，但有研究表明，多种病原所引起的免疫抑制与IL-2或IL-2R的表达紊乱有关[14]。李庆章等[15]报道，鸡马立克病病毒和鸡传染性贫血病毒感染后，鸡胸腺、脾脏T细胞对有丝分裂原反应下降，IL-2 分泌受到抑制。这些研究表明，病毒可能通过直接或间接干扰IL-2 合成导致免疫抑制。

目前，国内对于IL-2 的研究主要集中于哺乳动物尤其是人IL-2，而对鸡IL-2 的研究还十分有限，但因为IL-2 具有种属特异性，鸡IL-2 与哺乳动物IL-2 同源性相差较大，无交叉反应性，故目前很多可用于哺乳动物的实验技术及从市面上商品化的检测试剂盒不能用于鸡IL-2 的研究，极大的限制了对于鸡IL-2的深入研究。

在本研究中，我们利用诱导表达的His-chIL-2 蛋白免疫小鼠，按照常规方法取脾与骨髓瘤细胞进行融合，同时用GST-chIL-2 作为筛选蛋白，利用间接ELISA 方法筛选阳性杂交瘤。经过3 次亚克隆后共获得3株能稳定分泌chIL-2抗体的杂交瘤。经过一系列特性检测确定此3 株单抗均有较好的特异性和较高的亲和力，而且这些单抗识别不同的抗原表位区域。在确定单抗识别的抗原表位区域时，由于chIL-2 的N 端有一段大小为11个氨基酸的信号肽，为了能更好的筛选到识别chIL-2 的单抗，故首先设计了去除信号肽的成熟chIL-2 即MIL-2，大小约121 个氨基酸，在此基础上又分别从其C 端和

图2 chIL-2单克隆抗体亲和力的测定

图3 单抗识别抗原表位分析及特异性鉴定

A：各截短蛋白示意图 ； B：Western Blot分析3株单抗对不同截短蛋白的识别情况 ；C：3株单抗抗原表位识别区域示意图 ； D：3株单抗特异性鉴定N端以40个氨基酸为一段对成熟chIL-2进行截短。在WesternBlot中，MIL-2有时会曝出两条带，用抗His单抗作为一抗曝出的条带尤为明显。其原因是由于蛋白发生部分降解，故会曝出一条小于MIL-2正常大小的条带，而与单抗的特异性无关。综上所述，本研究所获得的3株chIL-2单抗具有特异性好、效价高的优点，可用于建立检测鸡IL-2方法或试剂盒，为深入研究鸡IL-2的生物学作用提供物质基础。

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Development and identification of monoclonal antibodies against chIL-2

FU Meng-jiao ， WANG Yong-qiang ， CAO Hong ，LI Xiao-qi ， ZHENG Shi-jun

(State Key Laboratory of Agrobiotechnology，College of Veterinary Medicine，China Agricultural University，Beijing 100193，China)

To develop monoclonal antibodies against chicken IL-2，We constructed the prokaryotic expression vector of chIL-2 and expressed His-chIL-2 protein first，and then immunized BALB/c mice with purified HIS-IL-2 protein.After three-time immunizations we obtained hybridomas via fusion of mouse spleen with sp2/0 myeloma.Indirect ELISA method was used to screen fused cells for positive hybridomas.Finally we got three hybridomas that could stably secret chIL-2 McAbs，and these hybridomas were named 1C2，2F2，and 4B5 respectively.The characteristics of the three McAbs were determined，and the results showed that the isotypes of these McAbs were IgG1.We examined the dissociation constants(Kd)of these McAbs，and found that their Kds were 4.81×10-10，1.36×10-10，4.15×10-9，respectively.The recognizing domains of chIL-2 by 1C2，2F2 and 4B5 were located in three different areas as demonstrated by Western Blot analysis.And three monoclonal antibodies could specifically recognize chIL-2.These McAbs would help to elucidate the functions of chIL-2.

chIL-2 ; prokaryotic expression ; monoclonal antibodies

s: ZHENG Shi-jun ； LI Xiao-qi

2015-08-11

现代农业产业技术体系建设专项资金(NYCYTX-41)

付梦姣(1989-)，女，博士生，从事预防兽医学研究，E-mail：rainshenmin@163.com

郑世军，sizheng@cau.edu.cn；李晓齐，leexiaoqi@cau.edu.cn

S852.4

A

0529-6005(2016)11-0006-04