BRAFV600E基因检测对良恶性甲状腺结节的诊断价值

钱伟明，姜协，邵荣，薛剑，王鹏

1.江苏省常州市武进中医医院，江苏 武进 213003；2.军事医学科学院 附属医院，北京 100071

BRAFV600E基因检测对良恶性甲状腺结节的诊断价值

钱伟明1，姜协1，邵荣1，薛剑2，王鹏1

1.江苏省常州市武进中医医院，江苏 武进 213003；2.军事医学科学院 附属医院，北京 100071

目的：探讨BRAFV600E基因检测在甲状腺结节中的诊断价值，评估其诊断良恶性甲状腺结节的应用价值。方法：选取2015年1～12月江苏省常州市武进中医医院收治的甲状腺结节患者，入院后测定BRAFV600E基因表型，采用细针穿刺细胞学（FNAC）检测其性质，采用手术组织病理学对患者甲状腺结节进行良恶性鉴别，分析BRAFV600E基因与良恶性结节的相关性，评估其对于甲状腺结节良恶性鉴别的指导价值。结果：共入组甲状腺结节患者92例，其中恶性65例；多因素分析表明BRAFV600E基因突变与恶性甲状腺结节呈相关性（P＜0.01），OR为44.42（95%CI：5.66～348.44）；BRAFV600E基因突变预测其恶性甲状腺结节发生的敏感性和特异性分别为63%（95%CI：0.50～0.74）和96%（95%CI：0.79～0.99）。结论：BRAFV600E突变与甲状腺癌的发生有显著的相关性，其能显著提高良恶性甲状腺结节的检出率。

BRAFV600E基因；甲状腺结节；诊断价值

甲状腺结节是指各种原因导致的甲状腺内出现一个或多个结构异常团块，临床发生率逐年升高[1]。由于良恶性甲状腺结节两者间并没有特征性的差异征象，因而目前在临床上还没有无创检测标志物可以对二者进行鉴别。细针穿刺细胞学（fine-needle aspiration cytology，FNAC）检查是目前判定甲状腺结节性质最为常用的检查方法[2]。但由于细针穿刺时所获得的结节标本量少，且诊断依赖于操作医师及病理医师的经验，因而仍有较高的假阳性率和假阴性率，严重影响诊断的准确度，限制了其临床的更广泛应用。

小鼠肉瘤病毒癌基因同源物B1（V-raf mu⁃rine sarcoma viral oncogene homolog B1，BRAF）基因位于人染色体7q34，包含18个外显子，编码相对分子质量约94×103的蛋白质，包含783个氨基酸残基，属于丝/苏氨酸蛋白质激酶类[3]。研究表明，BRAFV600E基因突变与甲状腺癌的发生有密切关联[3-4]，但是BRAFV600E基因检测在甲状腺结节中的诊断价值尚缺乏临床证据，其与临床常用的FNAC联合诊断良恶性甲状腺结节的应用价值尚待进一步研究证实。

在此，我们检测了甲状腺结节患者中BRAFV600E基因的突变水平，旨在讨论其在甲状腺结节定性诊断方面的诊断与应用价值。

1 材料与方法

1.1 病例资料

选取2015年1～12月江苏省常州市武进中医医院的甲状腺结节患者92例。所有患者均行FNAC及手术切除甲状腺结节，其中男性23例、女性69例，均无高血压、冠心病、肝肾功能障碍、精神异常及长期应用药物及其他肿瘤病史。年龄为26～67岁，平均43.38岁，甲状腺结节大小1.2～2.8 cm。

1.2 FNAC穿刺方法及细胞学诊断标准

1.2.1 FNAC穿刺方法 患者排除细针穿刺术禁忌症，术前签署知情同意书。取仰卧位，使其肩部垫高约15°～30°，充分暴露颈前区。超声波定位穿刺点，消毒，铺无菌洞巾，2%利多卡因局部麻醉，使用一次性穿刺活检针，在超声波引导下沿预定针道进入结节中心，每个结节穿刺3针，标本涂片3～4张，95%乙醇固定。

1.2.2 细胞学分类 所有入组病例均获得细胞学诊断，按照甲状腺细胞病理分类标准［①无法诊断；②良性病变；③不能明确意义的滤泡病变或不典型病变；④滤泡性或嗜酸性肿物；⑤可疑恶性；⑥恶性］，本研究将⑤、⑥统一归类为细胞学阳性，将①～④归类为细胞学阴性[5-6]。

1.3 BRAFV600E基因突变检测

采用荧光PCR法检测BRAFV600E基因，血液基因组提取试剂盒由天根生化科技公司提供，检测试剂盒为北京华迈生物科技公司生产的人类BRAFV600E基因突变荧光PCR检测试剂盒。取500 μL EDTA抗凝静脉血，提取基因组DNA。基因组DNA浓度为20～200 ng/μL，DNA的D260nm/D280nm为1.7～2.0。利用荧光定量PCR仪对荧光信号强度进行检测，计算ΔCt值（ΔCt值=突变检测Ct值-质控检测Ct值），结果定性分析。若ΔCt≥28，样本为阳性；若ΔCt＜28，样本为阴性。

1.4 统计学处理

采用SPSS 20.0统计学软件，计量资料以x±s表示，通过t检验分析；计数资料通过卡方检验分析；P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 良恶性甲状腺结节患者BRAFV600E基因突变类型比较

共入组92例甲状腺结节患者，所有患者均经手术切除。术后病理结果示：恶性65例，其中乳头状癌63例、滤泡状癌2例；良性27例，全部为结节性甲状腺肿，其中3例伴局部滤泡上皮异性增生。根据手术切片病理结果，将患者分为恶性组与良性组，比较2组间BRAFV600E基因突变比例。同时对可能的甲状腺结节的相关危险因素进行分析，比较了2组间年龄、性别、糖代谢能力（糖代谢异常包括糖尿病前期和2型糖尿病）、结节数、累积腺叶情况、结节回声结构及FNAC穿刺结果。见表1。

2.2 BRAFV600E基因突变类型与恶性甲状腺结节的多因素分析

多因素logistic回归分析显示BRAFV600E基因突变与恶性甲状腺结节呈相关性（P＜0.01），是恶性甲状腺结节高危患者的独立危险因素（OR= 44.42；95%CI：5.66～348.44）。同时，甲状腺结节回声结构也是良恶性甲状腺结节的可能危险因素，其囊性回声结节与混合性回声结节均提示其良性甲状腺结节的可行性，结节为实性结构的患者恶性甲状腺结节的风险增加3.2倍（OR=3.23；95%CI：2.36～5.27）。见表2。

2.3 BRAFV600E基因突变诊断恶性甲状腺结节的敏感性与特异性

对BRAFV600E基因突变预测其后甲状腺结节良恶性程度的敏感性与特异性进行了分析。所有入组患者中，BRAFV600E基因突变预测其恶性甲状腺结节发生的敏感性和特异性分别为63%（95% CI：0.50～0.74）和96%（95%CI：0.79～0.99）。与临床目前常用的细针穿刺相比，其诊断特异性显著升高。不仅如此，本研究表明基因检测联合穿刺检测能显著提高其诊断敏感性（77%，95%CI：0.65～0.86）与特异性（0.96，95%CI：0.79～0.99），见表3。

表1 良恶性甲状腺结节患者临床资料比较

表2 BRAFV600E基因突变与恶性甲状腺结节的多因素分析

表3 不同检查方式诊断良恶性甲状腺结节的敏感性与特异性

3 讨论

随着影像学检查和超声波检查的普及与广泛应用，无症状甲状腺结节的发生率明显增多。甲状腺炎症、增生及良恶性肿瘤等多种疾病均可表现为甲状腺结节，不同发病原因所致的甲状腺结节其处理方式截然不同，恶性结节应尽早行外科手术处理，良性结节可保守内科治疗[1,7]。因此，对甲状腺结节的良恶性鉴别是其后续治疗的基础与前提。

然而，良恶性甲状腺结节缺乏特征性的差异表现，二者在临床上尚无直接有效的鉴别手段。既往研究表明，性别、年龄、糖代谢能力，以及结节的超声波特征如结节数、累及腺叶、结节回声结构等因素为甲状腺恶性结节的相关危险因素[4,8]。本研究结果表明，除甲状腺结节超声波回声结构外，其他因素在良恶性甲状腺结节鉴别中均没有统计差异，意味着仅仅根据患者病例特征和结节超声波特点无法对良恶性结节进行有效鉴别。

本研究结果表明BRAFV600E突变与甲状腺癌的发生有显著的相关性，其能显著提高良恶性甲状腺结节的检出率。BRAFV600E基因突变是目前研究最为深入的甲状腺癌基因突变类型。BRAFV600E基因位于人染色体7q34，既往研究证实其突变大多位于第1799位点，BRAFFT1799A（V600E）位点与RAS蛋白结合后发生谷氨酸至缬氨酸的点突变，因而引起了MAPK通路中REK和MEK的肿瘤基因的级联激活反应[4,9]。另一项多中心临床研究表明[5-6]，BRAFV600E突变与甲状腺癌的淋巴结转移、甲状腺外侵犯、癌症复发及甲状腺癌Ⅲ、Ⅳ期明显相关。随后很多研究也证实BRAFV600E突变与甲状腺乳头状癌的复发显著相关[10-13]。不仅如此，BRAFV600E突变与复发性甲状腺乳头状癌的放射性碘亲和性降低有一定的相关性，其可能与放射性碘治疗效果不佳有关[14]。BRAFV600E突变可导致甲状腺癌的侵袭性增加，最终使甲状腺癌治疗失败。BRAFV600E突变也能导致很多促肿瘤分子的过表达，如VEGF、MET等[15]。本研究入组92例患者中，仅有1例突变术后病理未达诊断标准，提示BRAFV600E突变对于恶性甲状腺结节有高度的特异性。既往文献表明，BRAFV600E基因突变是甲状腺乳头状癌形成的重要环节，在甲状腺乳头状癌的发生发展中起着非常重要的作用。但是独立的BRAFV600E突变检测的敏感性低于FNAC，独立检测也难以满足临床需求。

FNAC是目前甲状腺结节性质判定最为常用的检查方法，也是术前评估甲状腺结节良恶性敏感性和特异性较高的方法。有研究入组了数百名甲状腺结节患者，比较其FNAC与术后组织病理检查的差异，FNAC的假阳性率和假阴性率分别为1.9%、10.5%，敏感性和特异性分别为89.5%、98%[12]。FNAC的检查结果多依赖于操作者的熟练程度和细胞病理学检查水平的要求。本研究入组的92例患者中共有16例甲状腺癌（15例乳头状甲状腺癌，1例滤泡状癌）患者被诊断为良性，考虑细针穿刺时未取得结节中恶性病变部位所致可能，计算其单独FNAC穿刺鉴别良恶性甲状腺结节的敏感性为74%，特异性为78%。因此，不可否认，单独采用FNAC作为鉴别甲状腺良恶性结节的检测手段缺乏可靠性。针对FNAC不能明确的甲状腺结节的问题，很多学者提出通过检测甲状腺组织或甲状腺细针穿刺样本中的甲状腺癌分子标志物来明确诊断。

本研究将BRAFV600E与FNAC联合进行良恶性诊断的预测，其结果表明二者联合诊断的敏感性与特异性为77%和96%，进一步计算诊断的阳性预测值及阴性预测值分别为98%和63%，提示联合检测对于甲状腺结节患者良恶性的诊断有很强的指导意义。BRAFV600E基因突变对于恶性甲状腺结节有高的敏感性，其有助于在FNAC穿刺细胞形态学不典型和取样效果不佳的情况下做出有效的鉴别诊断，对细胞形态不典型和可疑时对明确肿瘤的性质具有重要意义。

综上所述，本研究证实BRAFV600E突变与甲状腺癌的发生有显著的相关性，其能显著提高良恶性甲状腺结节的检出率。但BRAFV600E突变检测的敏感性较低，独立检测难以满足临床需求。而BRAFV600E与FNAC联合检测可以有效识别甲状腺恶性结节的高危患者，为临床医生的早期治疗策略提供重要依据。

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Value of BRAFV600EGenetic Testing for Diagnosis of Benign and Malignant Thyroid Nodules

QIAN Wei-Ming1,JIANG Xie1,SHAO Rong1,XUE Jian2,WANG Peng1*
1.Changzhou Wujin Chinese Medicine Hospital,Wujin 213003;2.Affiliated Hospital of Academy of Military Medi⁃cal Sciences,Beijing 100071;China

Objective:To evaluate the diagnostic value of the BRAFV600Egenetic testing in thyroid nodules and as⁃sess its value diagnosis combined with fine-needle aspiration cytology（FNAC）of benign and malignant thyroid nod⁃ules used in clinical.Methods:We enrolled the thyroid nodules patients treated in Wujin Chinese Medicine Hospi⁃tal from January to December 2015.We determinated the BRAFV600Ephenotype and FNAC after admission,using the surgical histopathology performed on patients with benign and malignant thyroid nodules.Results:A total of 92 thyroid nodules patients were enrolled,including 65 cases of malignant nodules.Multivariate results showed that the mutation of BRAFV600Eand malignant thyroid nodules were correlated,the risk increased 44.42 times（OR= 44.42,95%CI:5.66～348.44）.The mutation of BRAFV600Epredicts the occurrence of malignant thyroid nodules sen⁃sitivity and specificity were 63%（95%CI:0.50～0.74）and 96%（95%CI:0.79～0.99）.Conclusion:The mutation of BRAFV600E,which can significantly improve the detection of benign and malignant thyroid nodules rate incidence of thyroid cancer has a significant correlation with the incidence of thyroid cancer.

BRAFV600Egene;thyroid nodulesl;diagnostic value

R446;Q789

A

1009-0002（2017）02-0123-05

10.3969/j.issn.1009-0002.2017.02.011

2016-10-09

钱伟明（1973-），男，副主任医师

王鹏，（E-mail）wangpengwjzyyy@163.com

*Corresponding anthor,E-mail:wangpengwjzyyy@163.com