莫诺苷对人恶性黑色素瘤细胞增殖及凋亡的调控机制

李娜，李绍民，张宁，王加志，陈景华

1.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040；2.佳木斯大学 附属第一医院，黑龙江 佳木斯 154002

莫诺苷对人恶性黑色素瘤细胞增殖及凋亡的调控机制

李娜1，李绍民2，张宁1，王加志1，陈景华1

1.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040；2.佳木斯大学 附属第一医院，黑龙江 佳木斯 154002

目的：探究莫诺苷对人恶性黑色素瘤细胞A375增殖及凋亡的影响及作用机制。方法：将莫诺苷作用于A375细胞，采用MTT法测定细胞活力，Annexin-FITC/PI双染色流式细胞术检测各组细胞凋亡率，Western印迹检测细胞周期蛋白D1、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子P21、凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax的表达水平。结果：与空白对照组比较，顺铂阳性药和高中低浓度莫诺苷均能明显抑制细胞增殖（P＜0.01），明显下调周期蛋白D1和凋亡因子Bcl-2的表达水平（P＜0.01或P＜0.05），明显上调P21和促凋亡因子Bax的表达水平（P＜0.01）。结论：莫诺苷能抑制人恶性黑色素瘤细胞增殖和促进其凋亡，其机制可能是通过下调周期蛋白D1和Bcl-2蛋白的表达水平，上调P21和Bax蛋白的表达水平，调控周期蛋白D1-CDK-P21通路及凋亡通路，从而促进恶性黑色素细胞的凋亡。

莫诺苷；人恶性黑色素瘤；细胞周期；细胞凋亡；A375细胞

［Key words］monornide;human malignant melanoma;cell cycle;cell apoptosis;A375 cell

莫诺苷是存在于山茱萸和接骨木等中药中的环烯醚萜苷类成分[1-2]，具有抗氧化、抗凋亡、延缓衰老、抗炎[1]和抗肿瘤[3]等广泛的药理作用。研究表明，环烯醚萜苷类成分马钱苷能明显抑制黑素瘤细胞的生长[4]，推测莫诺苷也应当具有抗黑色素瘤的潜力，其作用机制有待开发。目前细胞周期、相关周期蛋白及凋亡蛋白成为研究肿瘤发生及防治的热点，细胞的增殖、分化、衰老、凋亡均是周期依赖性的[5]，细胞周期主要通过周期蛋白-CDK-CKI途径调控[6]。本研究以莫诺苷为实验用药，以人恶性黑色素瘤细胞A375为受试细胞，以治疗恶性黑色素瘤细胞的一线药物顺铂作为阳性对照药，从分子和细胞水平研究了人恶性黑色素瘤细胞增殖及凋亡过程中相关蛋白的变化，探索莫诺苷的作用机制，为寻找和开发抗黑素瘤的有效药物提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

A375细胞购自上海中乔新舟公司；莫诺苷购自成都曼斯特科技有限公司；DMEM培养液购自Gibco公司；胎牛血清、MTT购自Sigma公司；胰蛋白酶购自Billab公司；HRP标记的羊抗小鼠IgG购自北京中杉金桥生物技术有限公司；HRP标记的羊抗兔、兔抗Bcl-2和兔抗Bax购自武汉博士德生物工程有限公司；顺铂和AnnexinⅤ-FITC细胞凋亡检测试剂盒购自碧云天生物技术公司。

HPC-150便携式流式细胞仪购自Handyem公司；Cham1Ge15000凝胶成像仪购自北京赛智创业科技有限公司；MK3型酶标仪购自上海热电仪器有限公司；TGL-16G-C型高速台式冷冻离心机购自上海安亭科学仪器厂；HF90型二氧化碳培养箱购自上海智城分析仪器有限公司。

1.2 配制药液

用分析天平精密称取莫诺苷4.01 mg，用分析纯DMSO溶解配制成199.31 mmol/L的母液，吸取5 μL定容至10 mL配成0.1 mmol/L的溶液，然后用 DMEM分别稀释至 0.01、0.001 mol/L，用0.22 μm滤膜过滤除菌，于-20℃保存。精密称取顺铂 3.00mg，用 DMSO溶解配制成 199.6334 mmol/L的母液，吸取5 μL定容至0.1 mmol/L，再用DMEM培养基稀释至0.01 mmol/L，用0.22 μm滤膜过滤除菌，-20℃保存。

1.3 分组及给药处理

分为空白对照组、顺铂阳性对照组、莫诺苷组（包括高、中、低3个浓度组）。将体外培养的对数期A375细胞以5000/mL的密度接种于96孔板中，每孔200 μL，在培养箱中培养24 h，弃去培养液，空白组每孔加入200 μL DMEM培养液，阳性组加入0.01 mmol/L顺铂200 μL，高、中、低浓度给药组分别加入0.1、0.01、0.001 mmol/L莫诺苷药液200 μL，每组设6个复孔。将另一部分细胞按105/mL接种于6孔板中，每孔2 mL，在培养箱中培养24 h，弃去培养液，空白组每孔加入2 mL DMEM培养液，阳性组加入0.01 mmol/L顺铂2 mL，高、中、低浓度给药组分别加入0.1、0.01、0.001 mmol/L莫诺苷药液2 mL，每组设4个培养孔做平行对照。培养24 h后分别进行MTT、细胞凋亡检测和Western印迹试验。

1.4 细胞活性检测

每组细胞给药处理24 h后，每孔加20 μL 5 mg/mL的MTT，继续培养4 h，每孔加150 μL DMSO，恒温摇床振荡10～15 min使结晶物充分融解。测定各孔的D490nm值。

1.5 细胞凋亡率检测

用缓冲液洗涤细胞，弃上清，再用缓冲液重悬细胞，调整细胞浓度为2×105～5×105/mL，取195 μL细胞悬液加5 μL AnnexinⅤ-FITC，混匀，室温孵育10 min，再用缓冲液洗涤细胞1次，用190 μL缓冲液重悬细胞，最后加10 μL PI，用流式细胞仪检测，以未经AnnexinⅤ-FITC和PI染色的细胞为对照。每样本收集1.0×104细胞的荧光信号，采用Flowjo软件分析结果。

结果判断：AnnexinⅤ-FITC和PI双阴性为活细胞，AnnexinⅤ-FITC阳性而PI阴性为早期凋亡细胞，AnnexinⅤ-FITC和PI双阳性为晚期凋亡细胞，AnnexinⅤ-FITC阴性而Pl阳性为坏死细胞。

1.6 Western印迹检测莫诺苷对周期蛋白D1、P21、Bax和Bcl-2蛋白表达的影响

收集细胞，每孔加100 μL RIPA裂解液裂解细胞，提取蛋白。根据BCA试剂绘制标准曲线，测定每组样品蛋白浓度，控制相同的上样量。蛋白经变性后上样，经SDS-PAGE分离，半干法转膜，封闭液封闭2 h，一抗孵育，4℃过夜；二抗室温孵育1 h，TBST漂洗3～4次，滴加ECL曝光液，在凝胶成像系统中曝光。用Lane 1D软件对各组条带灰度值进行分析，以目的条带和内参条带的灰度值的比值反映各组的差异。

1.7 统计处理

实验数据以x±s表示，组间比较用SPSS 23.0软件进行单因素方差分析（one way ANOVA），P＜0.05有统计学意义

2 结果

2.1 莫诺苷对A375细胞活性的影响

结果见图1，与空白组相比，阳性组顺铂和莫诺苷高中低剂量组均能明显抑制A375细胞的增殖（均为P＜0.01），作用强度呈剂量依赖性。提示莫诺苷与顺铂相似，都具有抑制人恶性黑色素瘤细胞的作用。

图1 莫诺苷对A375细胞活性的影响

2.2 流式细胞术检测莫诺苷对A375细胞凋亡率的影响

结果见表1，与空白组相比，阳性组顺铂和莫诺苷高中低剂量组均能明显促进A375细胞的凋亡（均为P＜0.01），作用强度呈剂量依赖性。提示莫诺苷和顺铂相似，都具有促进人恶性黑色素瘤细胞凋亡的作用。

2.3 莫诺苷对A375细胞周期蛋白D1和P21表达的影响

结果见图2，与空白对照组相比，阳性组顺铂和莫诺苷高中低剂量组均明显上调P21蛋白的表达（均为P＜0.01），下调周期蛋白D1的表达（P＜0.01或P＜0.05），差异均有统计学意义，两者的蛋白表达量呈剂量依赖性。提示莫诺苷和顺铂相似，都具有抑制人恶性黑色素瘤细胞周期进程的作用。

2.4 莫诺苷对A375细胞凋亡蛋白Bax和Bcl-2表达的影响

结果见图3，与空白对照组相比，阳性组顺铂和莫诺苷高中低剂量组均明显上调Bax蛋白的表达（均为P＜0.01），下调Bcl-2蛋白的表达（均为P＜0.05），差异均有统计学意义，两者的蛋白表达量变化均显示有剂量依赖性。

表1 莫诺苷作用A375细胞后的细胞凋亡率

图2 莫诺苷对A375细胞周期蛋白D1和P21蛋白表达的影响

3 讨论

图3 莫诺苷对A375细胞Bax和Bcl-2蛋白表达的影响

黑色素瘤恶性程度极高，占皮肤肿瘤死亡病例的极大部分，多发生于皮肤或接近皮肤的黏膜，发病具有隐袭性，预见性差，进展快，易发生血路和淋巴转移，患病率逐年升高[7-8]。目前的治疗手段主要集中在放疗、化疗和手术治疗等，因此开发有效药物、有效途径、有效方法至关重要。

研究证实，来自山茱萸的环烯醚萜苷类成分马钱苷具有抑制人恶性黑色素瘤细胞增殖和促进细胞凋亡的作用[4]。作为一种从中药山茱萸中提取的环烯醚萜苷类活性成分，莫诺苷是否与马钱苷有类似药理作用，值得探究。

本研究表明莫诺苷对人恶性黑色素细胞具有抑制增殖和促进凋亡的作用，且功效与剂量呈正相关，表明莫诺苷具有抗人恶性黑色素瘤细胞的作用，其作用机制可能是对细胞周期和凋亡机制共同调节的结果。

国内外研究均表明，恶性黑色素瘤是由于黑色素细胞无限制的分裂和增殖不可控制引起的，细胞周期调节是肿瘤发生的关键，细胞周期由细胞周期蛋白、周期蛋白依赖性激酶（CDK）和周期蛋白依赖性激酶抑制因子（CKI）调节，即周期蛋白-CDK-CKI途径，以CDK为核心，通过周期蛋白的正向调节和CKI的负向调节使细胞周期协调平衡[9-10]，一旦平衡被打破，细胞就会无限增殖导致癌变。调节细胞周期G1/S期主要的细胞周期蛋白是D1[11]，沈立军[12]等发现上调ERα和下调ERβ可使周期蛋白D1过度表达，导致甲状腺上皮细胞失控增殖进而引发癌症。茹艺[13]等发现周期蛋白D1的过度表达能促进贲门癌的发生发展。所以周期蛋白D1的异常表达与肿瘤的发生发展密切相关。P21为CKI家族成员，是一种广泛的激酶抑制剂，能抑制周期蛋白D1的活性，导致细胞周期停滞，阻断细胞的增殖过程，对细胞生长起负调控作用[14]。P21的低表达使得其对细胞周期的抑制作用减弱，使肿瘤细胞的失控增殖有了可能。本研究显示，与空白对照组比较，莫诺苷能明显降低周期蛋白D1的表达，升高P21的表达，从而抑制细胞的增殖。

细胞凋亡与肿瘤的发生发展密切相关[15]，许多抗肿瘤药都通过诱导凋亡达到治疗目的。作为调节凋亡的2个典型蛋白，Bcl-2和Bax在受到相关上游信号刺激时会通过聚体的方式调节凋亡。Bcl-2和Bax的表达与肿瘤的发生发展关系密切。王红梅[16]等发现姜黄素能通过升高Bax的表达、降低Bcl-2的表达，促进恶性黑色素瘤细胞的凋亡。党文军[4]等发现马钱苷也能上调Bax表达、下调Bcl-2表达，促进黑色素瘤细胞凋亡。本实验发现，与空白对照组比较，莫诺苷能剂量依赖性地升高Bax的表达，降低Bcl-2的表达，从而诱导细胞凋亡。

综上所述，莫诺苷可能是通过调节周期蛋白D1-CDK-P21途径，影响人恶性黑色素瘤细胞的细胞周期，降低Bcl-2和升高Bax的表达，从而促进人恶性黑色素瘤细胞A375凋亡，发挥抗肿瘤的机制。

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Proliferation and Apoptosis Regulatory Mechanism of Mor⁃roniside on Human Malignant Melanoma Cells

LI Na1,LI Shao-Min2,ZHANG Ning1,WANG Jia-Zhi1,CHEN Jing-Hua1*
1.Heilongjiang University of Chinese Medicine,Harbin 150040;2.First Affiliated Hospital of Jiamusi University, Jiamusi 154007;China

Objective:To investigate the effects of morroniside on proliferation and apoptosis mechanism of hu⁃man malignant melanoma cells.Methods:Morroniside was applied to A375 cells,and then cell proliferation was determined by MTT assay,cell apoptosis rate was detected by Annexin-FITC/PI double staining flow cytometry.Cy⁃clin D1,P21,Bcl-2 and Bax protein were examined by Western blotting.Results:Compared with blank control group,cisplatin-positive control group and different concentration of monornide group inhibited cell proliferation（P＜0.01）.Cyclin D1 and Bcl-2 was down-regulated（P＜0.01 or P＜0.05）,and P21 and Bax protein was up-regulated by cisplatin-positive controlgroup and differentconcentration ofmonornide group（P＜0.01）.Conclusion: Monornide significantly inhibits cell proliferation and promotes cell apoptosis,which may be associated with regula⁃tion of cyclin D1-CDK-P21 pathway by decreasing cyclin D1 and Bcl-2,and apoptosis pathway by improving P21 and Bax.

Q25

A

1009-0002（2017）02-0128-05

10.3969/j.issn.1009-0002.2017.02.012

2016-10-31

黑龙江省教育厅科学技术研究项目（12521501）

李娜（1984-），女，硕士研究生

陈景华，（E-mail）734521616@qq.com

*Corresponding anthor,E-mail:734521616@qq.com