3G-ELISA新方法在促肾上腺皮质素释素检测中的应用

李光宗，陈锋，刘英富，张益，郁硕，樊毫军，侯世科

武警后勤学院 a.附属医院救援医学研究所，天津 300162；b.附属医院灾害应急救援医学全军重点实验室，天津 300162；c.细胞生物与医学遗传学教研室，天津 300309

技术方法

3G-ELISA新方法在促肾上腺皮质素释素检测中的应用

李光宗a，陈锋b，刘英富c，张益a，郁硕a，樊毫军b，侯世科a

武警后勤学院 a.附属医院救援医学研究所，天津 300162；b.附属医院灾害应急救援医学全军重点实验室，天津 300162；c.细胞生物与医学遗传学教研室，天津 300309

目的：改进传统ELISA方法，提高其对痕量样本的检测灵敏度，降低检测限。方法：将一抗和二抗分别与纳米金和氧化石墨烯结合，应用于传统ELISA方法，通过纳米材料的信号放大作用，提高对痕量样本的检测灵敏度，降低检测限。结果：优化后的方法可对浓度为0.02 μg/mL的促肾上腺皮质素释素进行检测，灵敏度提高了125倍。结论：改进后的方法性能稳定，重复性好，可用于生物样本中痕量被检测物的测定。

酶联免疫吸附测定；纳米金；氧化石墨烯；促肾上腺皮质素释素

ELISA是目前在生物科研、临床诊断中检测痕量蛋白质使用最广的方法之一。该方法通过辣根过氧化物酶标记的试剂产生检测信号，对目标检测物进行定性或定量检测。自1971年被发明以来，ELISA一直受到广大使用者的青睐[1-2]。

但是，随着科研水平的不断提高，以及医学研究的更高要求，本方法也暴露出一些不足，如检测限不够低，须消耗大量价格昂贵的抗体[3-4]。为了解决这一问题，已开展了很多相关研究，其中最具代表性的是将纳米材料引入传统的ELISA方法中，对其检测限进行优化。本文介绍了将纳米金（gold nanoparticles，GNPs）和氧化石墨烯（graphene oxide，GO）2种纳米材料同时引入ELI⁃SA，先后2次使用GNPs，建立3G-ELISA（GNPs-GO-GNPs ELISA）新方法，并对其在促肾上腺皮质素释素（corticotropin releasing hormone，CRH）检测中的应用进行研究。

GNPs是最常用的一种纳米载体材料，具有诸多优点，如比表面积大、易于制备、粒径分布跨度大，而且与生物抗体结合后，不会破坏其生物活性。石墨烯是近几年兴起的纳米材料，具有二维单原子碳分子结构，具有比纳米金更大的比表面积、优异的导电性能，以及与生物良好的结合性能。3G-ELISA方法是将GNPs、GO、GNPs依次引入传统ELISA方法中，大大提高了其检测能力[5-18]。

1 材料与方法

1.1 材料

CRH来自雄性SD大鼠（SD大鼠为SPF级，购自军事医学科学院实验动物中心，生产许可证：SCXK-军-2012-0004）；CRH-Ab1、辣根过氧化物酶（HRP）、IgG-Ab2、assistant Ab1（aAb1，C-Myc-Ab1）均购自天津科昂利莱生物公司；牛血清白蛋白（BSA）、1-乙基-3-（3-二甲基氨）-碳二亚胺盐酸盐（EDC）、2-（N-吗啉）乙磺酸（MES）、N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）均购自Sigma-Aldrich公司；石墨购自Alfa Aesar公司；氯金酸（HAuCl4·4H2O）购自南京市威圣化工贸易有限公司；柠檬酸钠购自上海创顺化工有限公司；KH2PO4、Na2HPO4、KCl、Tween-20均购自北京化学试剂公司；实验用水为二次蒸馏水。

Milli-Q型密理博纯水仪（≥18 MΩ，Millipore公司）；Tecnai G2 20型透射电镜（FEI香港有限公司）；85-2数显型恒温搅拌器（国瑞试验仪器厂）。

1.2 GNPs与aAb1-GNPs-Ab1的制备与表征

1.2.1 纳米金的制备 将所用的玻璃器皿用浓酸浸泡48 h以上，然后用双蒸水洗涤干净；加入1 mL 1%的HAuCl4·4H2O，加热至沸腾，并不断搅拌，然后迅速加入1%的柠檬酸钠溶液2.5 mL，搅拌，并保持沸腾15 min；此时，溶液颜色开始由灰色逐渐变为紫色，最终变为酒红色；待溶液完全变为酒红色后，再保持沸腾10 min，然后停止加热，继续搅拌反应液15 min；待冷却至室温后，将产物封闭保存在深色玻璃瓶内，置于4℃备用。

1.2.2 纳米金与抗体的结合 将30 μg CRHAb1和aAb1（摩尔比为1∶10）加入制备好的1 mL纳米金溶液中，于室温反应2 h；然后加入BSA溶液封闭30 min，13 300 r/min离心10 min，溶液分为上下两层，上层为清澈的粉红色，下层为黑红色松软的沉淀物；除去上清，用PBS洗涤沉淀物，13 300 r/min离心10 min，再次用PBS溶液溶解，目的是提高生成物aAb1-GNPs-Ab1的稳定性，并最大限度地减少非特异性吸附；最后将产物置于4℃备用。图1是GNPs和aAb1-GNPs-Ab1的透射电镜图。

图1 GNPs（A）和aAb1-GNPs-Ab1（B）的透射电镜图

1.3 Ab2-GNPs-HRPs的制备与表征

将1.5 μL 5.0 mg/mL的Ab2和3.0 μL 5.0 mg/mL的HRP加入含0.04%柠檬酸钠、0.26 mmol/ L碳酸钾、0.02%叠氮化钠的1.0 mL纳米金溶液中，缓慢涡旋2 h，加入100 μL 1%的BSA封闭30 min，4℃、15 000 r/min离心20 min，然后用事先配好的洗液对产物洗涤3次，最后将产物Ab2-GNPs-HRPs溶解在含1%BSA的100 μL溶液中，置于4℃备用。

1.4 GO和GO-Ab2-GNPs-HRPs的制备与表征

氧化石墨烯的制备和GO-Ab2-GNPs-HRPs的合成均参考相关文献进行[10-16]。将 50 mg NaOH和ClCH2COONa加入1 mL 1 mg/mL的GO悬浮液中，水浴超声1.5 h，然后用双蒸水洗涤3次，除去未反应的试剂；将产物加入含400 mmol/ L EDC和200 mmol/L NHS的pH6.0的1 mL MES溶液中，经过30 min活化，除去多余的EDC和NHS，离心5 min，将产物分散在1.0 mL pH7.4的PBS中，在室温下振荡4 h，离心和洗涤3次后，将制备的GO-Ab2-GNPs-HRPs产物置于含1%BSA的PBS溶液中，并存放在4℃备用。图2是GO和GO-Ab2-GNPs-HRPs的透射电镜图。

2 结果

3G-ELISA在操作流程上与传统方法相似，不同之处在于对抗体的功能化修饰。3G-ELISA方法操作步骤如下：①固定抗原；②用BSA溶液封闭；③加入aAb1-GNPs-Ab1；④37℃孵育2 h，洗去多余抗体；⑤加入GO-Ab2-GNPs-HRPs；⑥37℃孵育40 min，洗涤；⑦加入显色底物，测量光密度值。

CRH是小分子肽激素和神经递质，主要由哺乳动物的下丘脑神经元合成并分泌，参与应激反应。高水平的CRH与急性高原病的发生直接相关，因此用血浆中CRH水平的高低来预测急性高原病的发生几率具有重要意义，该数据可以指导旅行或工作在高空中的人员作出必要的预防和控制措施，以尽量减少危害。CRH可同时在血液和和唾液中检测到，由于唾液样本容易获得、含有较少的干扰物等优点，本研究的CRH来自唾液，但缺点是唾液中的CRH含量明显低于其在血浆中的含量。

本研究通过传统的ELISA方法和改进后的3G-ELISA方法同时对CRH进行检测，检测信号大大提高。其信号放大原理如图3：第一步，纳米金结合高比例的一抗和辅助一抗，大大提高了一抗与抗原的结合比例；第二步，氧化石墨烯结合大量二抗，又提高了二抗与一抗的结合比例；第三步，每一个二抗又通过纳米金颗粒结合多个HRP，再一次提高了HRP与二抗的结合比例，将少量的抗原信号通过层层放大，达到了对痕量目标待测物的检测目的。2种方法对CRH的检测结果如图4，图4A是使用改进后的3G-ELISA方法得到的结果，能对前7个孔进行有效检测；图4B是用传统ELISA方法得到的结果，仅能对前4个孔进行有效检测。每相邻2孔的稀释比例为5倍，所以改进后方法的检测限降低为传统方法的1/125。

图2 GO（A）和GO-Ab2-GNPs-HRPs（B）的透射电镜图

图3 3G-ELISA方法信号放大原理图

图4 3G-ELISA（A）和传统ELISA（B）检测CRH

3 讨论

本研究中我们将3G-ELISA方法应用于对CRH的检测，通过纳米金和氧化石墨烯的引入，将检测限降低为原来的1/125；通过双一抗的引入，大大降低了成本。

另外，我们还引入了价格远低于一抗的辅助一抗，因此，本方法在放大检测信号的同时，还大大降低了成本，进一步拓宽了方法的实用性。

验证实验表明，改进后的ELISA方法对痕量目标检测物的检测能力进一步增强，适用范围进一步扩大。我们相信，该方法将会在临床鉴定、实验研究中发挥更大的作用。

参考文献

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Application of a Novel 3G-ELISA Method in Corticotropin Releasing Hormone Detection

LI Guang-Zonga,CHEN Fengb,LIU Ying-Fuc, ZHANG Yia,YU Shuoa,FAN Hao-Junb,HOU Shi-Kea*
a.Institute of Rrescue Medicine,Affiliated Hospital,Tianjin 300162;b.Key Laboratory of Disaster＆ Emergency Rescue Medicine in PLA,Affiliated Hospital,Tianjin 300162;c.Department of Cell Biology,Tianjin 300309;Lo⁃gistics University of Chinese People's Armed Police Forces,China

Objective:To improve the sensitivity and lower detection limit of ELASA assay for the detection of trace samples by modifying primary antibody and secondary antibody.Methods:Gold nanoparticles and graphene oxide were introduced into the traditional ELASA assay to amplify the detection signal.Gold nanoparticles com⁃bined with primary antibody,and graphene oxide with second antibody.Results:The optimized method can detect corticotropin releasing hormone of 0.02 μg/mL,and the sensitivity was increased by 125-fold.Conclusion:The method is stable,repeatable and can be used to detect trace biological samples.

enzyme-linked immunosorbent assay;gold nanoparticles;graphene oxide;corticotropin releasing hor⁃mone

Q502;R392.1

A

1009-0002（2017）02-0137-04

10.3969/j.issn.1009-0002.2017.02.014

2016-09-12

李光宗（1990-），男，硕士研究生

侯世科，（E-mail）shikeh_tj@126.com

*Corresponding anthor,E-mail:shikeh_tj@126.com