耐亚胺培南的肠杆菌科细菌耐药现状及机制

俞丁宁 胡铭斐 王科枰 周芳美⋆

作者单位：310000 浙江中医药大学医学技术学院

肠杆菌科细菌是寄居肠道的正常菌群，菌群失调时易造成尿路感染、血液感染等疾病，是医院和社区获得性感染的重要来源之一。亚胺培南为碳青霉烯类药物，抗菌能力强，临床上常把其作为多重耐药菌感染患者治疗的最后选择［1］。随着抗生素的广泛使用，肠杆菌科细菌对亚胺培南出现耐药现象，且耐药率在世界范围内呈上升趋势，这限制了临床用药，威胁着人类的健康。近几年“超级细菌”感染人数的增加，更是令人们对其担忧。而研究肠杆菌科细菌对亚胺培南的耐药机制，对控制感染性疾病的发生及临床治疗均有重要意义。

1 耐药现状

2017年耐碳青霉烯类抗生素的肠杆菌科细菌被世界卫生组织划分为“1类重点病原体”，可见其对人类健康危害之大。北京协和医院［2］与2016年全国细菌耐药监测数据［3］均显示耐亚胺培南的肺炎克雷伯菌近年来检出率明显上升，其中以ICU患者尤甚，可能是由于重症患者的病情需要用更大剂量的抗生素来控制所造成的。卫计委全国细菌耐药监测网（Mohnarin）2015-2016年革兰阴性菌耐药监测报告［4］中显示，肠杆菌科细菌对亚胺培南普遍存在抗性，其中肺炎克雷伯菌和阴沟肠杆菌对亚胺培南的耐药率在最近几年内上升较快，需引起高度关注。

美国CDC在2011～2014年有关疾病控制的报告［5］中显示肠杆菌科细菌对碳青霉烯类药物耐药率略有增加，以克雷伯菌属和大肠埃希菌尤甚，如尿路感染分离的肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类药物耐药率自2011年至2014年分别为10.7%、9.1%、10.9%、9.5%，均保持在10%的较高水平。EARS-Net 2016年报告［6］的欧洲耐碳青霉烯类大肠埃希菌检出率＜1%，但耐药肺炎克雷伯菌分离株检出率较高。上述数据分析可见，耐亚胺培南等碳青霉烯类药物的肠杆菌科细菌在不同地区都普遍存在，但耐药菌的流行分布不同，其中耐药肺炎克雷伯菌的检出率在世界范围内都较高，督促医疗机构需要采取更积极的措施以防止耐药菌株的爆发。

2 耐药机制

肠杆菌科细菌对碳青霉烯类抗生素亚胺培南耐药的机制主要有四个方面，分别是产碳青霉烯酶、膜孔蛋白的丢失与改变、主动外排作用增强及青霉素结合蛋白的改变［7］。

2.1 产碳青霉烯酶 细菌对碳青霉烯类抗生素耐药，很重要的原因是产生了碳青霉烯酶使药物灭活。碳青霉烯酶是指能够明显水解至少亚胺培南或者美罗培南的一类β-内酰胺酶。肠杆菌科细菌如大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、产气肠杆菌等菌株能够产生许多灭活碳青霉烯酶类抗生素的酶，该酶按照Ambler分类分为四类，其中A、B、D三类被认为是碳青霉烯酶［8］。（1）A类碳青霉烯酶： A类碳青霉烯酶主要包括NmcA，KPC、SME，IMI-1/2、GES等，是一种丝氨酸碳青霉烯酶，能够使碳青霉烯类、青霉素类、氨曲南类等多种抗生素水解灭活。克拉维酸能够抑制A类酶的活性，但其活性不被乙二胺四乙酸抑制［8］。1996年Yigit等［9］从一株耐药的肺炎克雷伯菌中发现了KPC酶。之后，美国、以色列、法国、中国等国家相继在多种肠杆菌科细菌中发现了这种酶。KPC酶有多种亚型，而在中国，耐亚胺培南的细菌主要产KPC-2型碳青霉烯酶［10］。产KPC酶是细菌获得耐药性的重要原因之一。Li等［11］发现大肠埃希菌获得KPC-2基因后，对亚胺培南的耐药性显著增加。Su 等［10］通过基因测序粘质沙雷菌产生的KPC-2与大肠埃希菌的共培养物，再次证实了KPC-2对亚胺培南耐药的作用。产KPC酶的菌株容易引起流行，这是因bla KPC基因位于可接合的质粒上，与转座子Tn4401结合，两侧的插入序列可以跟随转座子实现在不同菌株间的转移，其中ST -258序列有助于bla KPC基因的扩散［12］。这种传播机制明显加快细菌耐药性的传播。此外，在耐亚胺培南的肠杆菌科细菌中还发现较多其他A类酶，如NmcA、GES酶等，其中GES存在多种有水解活性的变异体，以GES-5对亚胺培南水解活性最强［13-14］。由此可见，酶发生变异，产生新的衍生物是近年来肠杆菌科细菌耐药性不断增强的重要原因之一。（2）B类碳青霉烯酶：B类碳青霉烯酶为金属酶，主要包括VIM、IMP、NDM-1等，可以水解除氨曲南之外的所有β-内酰胺类抗生素，其活性能被乙二胺四乙酸抑制，但不受到克拉维酸的抑制［8］。从粘质沙雷菌中分离第一个IMP-1到现在，已知的IMP酶变异体有48种，我国较为常见的为IMP-4，其通过质粒在菌株间传播，引起流行［15］。而目前产NDM-1的耐药肠杆菌科细菌是临床关注的焦点，因为其能表达多种药物灭活酶，引起细菌多重耐药，严重限制了临床用药［16］。此外，肠杆菌科耐药菌株中IMP-1、IMP-2、VIM等的检出预示B类碳青霉烯酶在临床上的流行［17］。B类金属酶对亚胺培南的水解作用是三类中最强的［7］，其又通过质粒扩散，引起产B类酶细菌的强耐药性和多重耐药，应该加强控制。（3）D类碳青霉烯酶：D类碳青霉烯酶中的OXA酶中只有少数类型对亚胺培南有水解活性，在耐药肠杆菌科细菌中流行的主要为OXA-48样碳青霉烯酶，其对亚胺培南具有很高的水解活性［12］。编码OXA-48的基因通过质粒在肠杆菌科细菌之间传播。目前国外发现了一种新型的OXA-48的衍生物OXA-162，bla OXA-162基因位于由两个IS1999-2元件组成的携带转座子的质粒上，其能够提高对亚胺培南的水解活性［18］，这是酶发生变异后，提高原有活性的又一个例子。

2.2 膜孔蛋白的丢失与改变 革兰阴性杆菌的细胞膜中镶嵌着膜孔蛋白，允许大多数抗菌药物跨膜进入菌体，影响着细胞膜的通透性。细胞膜的通透性与酶的作用共同影响着耐药效益。肺炎克雷伯菌与亚胺培南耐药有关的膜孔蛋白主要为OmpK35和OmpK36，其作用相当于大肠埃希菌的OmpF和OmpC［19］，若这两种膜孔蛋白表达下调或者功能改变，会降低药物的抑菌作用。Ye等［19］用SDS-PAGE发现耐药的肠杆菌科细菌与敏感菌株相比Omp蛋白下调。最近，韩国学者［20］通过 ERIC-PCR分析，发现在所有亚胺培南耐药的肠杆菌科细菌中，膜孔蛋白ompK35基因的表达均下调。此外，也有研究［21］证明膜孔蛋白下调合并灭活酶产生也是肠杆菌科细菌对亚胺培南耐药的影响因素之一。由此可见，OmpK35/36 膜孔蛋白表达的单独下调或合并灭活酶的共同作用是肠杆菌科对亚胺培南的敏感度下降的重要原因之一。

2.3 主动外排作用增强 主动外排系统是存在于细菌中的一组能将菌体内药物或其他物质排出体外的外排泵，能使达到作用位点的药物浓度下降而产生耐药性。其中，与肠杆菌科细菌耐碳青霉烯类药物有关的外排泵主要AcrAB-ToIC系统。临床分离的耐药大肠埃希菌通过分析发现AcrAB-ToIC外排泵基因表达上调而膜孔蛋白表达下调，使膜通透性下降［22］。由此可见，细菌细胞膜对抗生素的通透性与外排作用是相对的，膜通透性下降合并外排作用增强会导致菌体内药物浓度下降，细菌对药物敏感性降低。但也有研究发现外排泵基因AcrB的表达上调与细菌对亚胺培南耐药无关［20］。目前对于外排泵系统调控机制研究还不够深入，需要进一步探索，以解决由于外排作用而导致的耐药问题。

2.4 青霉素结合蛋白的改变 青霉素结合蛋白（Penicillin binding proteins，PBPs）是几乎存在于所有细菌内膜的一组有催化功能的酶，其能参与合成细胞壁和维持细胞形态［23］。当抗菌药物与PBPs结合后，会抑制PBPs的酶活性，引起一系列级联反应，导致细菌死亡。

在肠杆菌科中，对大肠埃希菌的PBPs的研究开展的最早。目前已知的大肠埃希菌的PBPs有12种。亚胺培南主要与PBP2及PBP3结合，其与PBP2结合后使细菌的形态发生改变，最终细菌溶解死亡；与PBP3结合后，能抑制大肠埃希菌的分裂［23］。除此之外，也有研究认为大肠埃希菌耐药与PBP5的改变有关［24］。因此，PBPs如发生突变，药物与作用靶位结合的亲和力下降，最终表现为细菌对抗菌药物的敏感性降低。

除了上述机制在肠杆菌科细菌耐药效益中的作用突出，另外，靶酶和竞争性靶酶底物合成上调、耐药基因及生物被膜的产生等也会影响细菌耐药［25-26］，但这些机制中有关亚胺培南耐药的肠杆菌科细菌的研究目前还不多，需要未来更加努力的探索。

3 耐药对策

3.1 抗生素的使用管理 耐药性的产生和变化大多起因于抗生素的滥用［12］。滥用抗生素使细菌发生变异，最终导致耐药性的产生和传播。细菌的耐药检测可以为临床抗生素的使用提供可靠的数据，因此加强耐药检测，合理利用抗生素便显得尤为重要。对于多重耐药菌［27］，更要注重控制院内感染和交叉感染的发生，如发生则要及时隔离患者、加强院内环境卫生、做好院内人员个人卫生宣传等减少耐药菌感染的流行。

3.2 联合用药 有研究发现［28］，有些既有抗菌药物同其他抗菌药物联合使用，治疗效果明显优于其单药治疗效果，如多粘菌素、磷霉素等，与其他抗菌药物一同使用时，可明显增强抗菌活性，延缓耐药菌的出现。虽然大多研究认为［28-29］使用联合治疗耐碳青霉烯类药物的肠杆菌科细菌效果优于单药治疗，但仍需进一步的研究验证。

3.3 新药研发 研发新型药物治疗感染势在必行。目前已证实［29］有效的耐碳青霉烯类药物的肠杆菌科细菌新药主要有碳青霉烯酶抑制剂复方制剂、甘酰胺环素、新型头孢菌素等，这几类药物主要通过抑制细菌蛋白合成、抑制酶产生、抑制细菌细胞壁合成等机制发挥抗菌作用。新药的研发不仅可以从这几方面继续深入研究，也有望从改变药物作用靶位或使用脂质体作为药物载体等方向进行研究，以避免外排作用等因素对药效的影响。

外排泵抑制剂能降低外排泵基因的表达，在一定程度上增加抗生素的敏感性，达到治疗的目的。目前有关治疗耐亚胺培南的肠杆菌科细菌感染的外排泵抑制剂的研究不多，国内外已知外排泵抑制剂主要有三酸盐、维拉帕米等［30］，但由于该类药物使用剂量对身体的副作用大，并未成功应用于临床。有研究证明［31］连翘酯苷B对治疗外排泵介导的细菌耐药也有效，因此可以从中药入手，充分发挥中药对于机体的调理作用，探索新的治疗途径。

4 展望

肠杆菌科细菌对于亚胺培南的耐药性有地区差异性，但在世界范围内总体呈上升趋势。肠杆菌科细菌耐亚胺培南的机制不是单一的，是多种机制间相互作用的结果，如细菌膜孔蛋白合成下调合并灭活酶的产生、细菌膜通透性下降合并主动外排作用增强或青霉素结合蛋白亲和力下降等。同时细菌产生的灭活酶可以发生变异，一些变异体的产生加强了细菌的耐药性，其能通过质粒在菌株传播，加速耐药性的扩散。肠杆菌科细菌耐药性的扩散以及新药研发缓慢，给临床带来困难，展望未来，通过对肠杆菌科细菌耐药性研究的深入，研究者们会发现更多安全有效的策略来解决肠杆菌科细菌耐药的问题。