熊果酸对酒精性肝损伤大鼠的保护作用及机制

叶泉英，林浩佳，陈金慧，彭政，陈启生

(1佛山科学技术学院口腔医学院，广东佛山528000；2南海人民医院)

肝脏是人体的中心代谢器官，肝硬化患者因肝功能低下，导致糖、脂肪和蛋白质代谢紊乱。随着我国嗜酒人群的不断扩大，酒精性肝病的患病率已跃升至第二位而仅次于病毒性肝炎[1]。相当数量的慢性酒精性肝病患者反复发病，久治不愈，最终可迁延为肝硬化、门脉高压、肝癌等终末期肝病。多项临床研究发现，酒精性肝损伤多伴随胰岛素抵抗，且随着肝损伤的加重，胰岛素抵抗现象更明显[2,3]。相关研究表明，熊果酸是存在于天然植物中的一种三萜类化合物，具有镇静、抗炎、抗菌、抗溃疡、降低血糖等多种生物学效应，熊果酸还具有明显的抗氧化功能[4～7]。我们通过乙醇灌胃建立大鼠急性肝损伤模型，探讨熊果酸对乙醇所致大鼠急性酒精性肝损伤的保护作用及机制。

1 材料与方法

1.1 材料 雄性清洁级SD大鼠(南方医科大学动物实验中心惠赠)32只，7～8周龄，体质量300～400 g。熊果酸(美国Axygen公司)，50%乙醇(美国Amresco公司)，联苯双酯(美国TargetMol公司)，10%甲醛溶液(上海康朗生物公司)，二甲苯(上海钰博生物公司)，各浓度乙醇(上海康朗生物公司)，苏木精染液(美国Sigma公司)，伊红染液(美国Sigma公司)，大鼠SOD检测试剂盒、MDA检测试剂盒(中国HZBscience公司)，血糖检测仪(美国通用公司)，全自动生化分析仪(美国通用公司)，石蜡切片机(美国Thermo公司)。

1.2 模型建立及分组 选择SD大鼠32只，在恒温且光照通风实验室适应性喂养。1周后随机将其分为4组：对照组、模型组、熊果酸组及联苯双酯组。每隔3 d称重。前2周，模型组、熊果酸组及联苯双酯组均隔天以50%乙醇灌胃1次。空白组不进行任何处理。后2周，对照组及模型组均隔天盐水灌胃1次，熊果酸组以熊果酸60 mg/kg隔天灌胃1次，联苯双酯组予联苯双酯隔天灌胃1次，给药量为5.625 mg/kg。末次灌胃后，大鼠禁食24 h。

1.3 样本采集 给药后每组大鼠均每隔3 d针刺尾部，应用血糖检测仪检测空腹末梢血糖。至第14天，眼眶取血，放入1.5 mL无菌离心管中，4 ℃条件下1 000 r/min离心15 min，分离上层血清。取上清于-20 ℃冰箱保存，备用。断颈处理大鼠，剖取肝脏称重，随即泡入10%中性甲醛溶液，放于-20 ℃冰箱保存，备用。

1.4 生化指标的检测 实验后2周各组大鼠完成给药后禁食24 h，处理大鼠分离血清，应用全自动生化分析仪检测空腹血糖(FPG)、血清胰岛素(FINS)、胰岛素敏感指数(ISI)、ALT、AST、GGT、TG，应用专用试剂盒检测大鼠超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)活性。

1.5 大鼠肝脏组织石蜡切片制备及病理切片观察 ①固定与取材：使用10%中性甲醛溶液固定SD大鼠的肝脏组织，24 h后分别从纵断面取材，修整成1 cm2左右，厚2 mm，随后流水冲洗8 h。②梯度脱水和透明：50%、75%乙醇6 h，85%乙醇3 h，95%、100%(Ⅰ)、100%(Ⅱ)乙醇1 h，然后用二甲苯(浓度为50%)浸泡0.5 h，全过程约18 h。适当轻微振荡或晃动组织块。③石蜡包埋：分别于52 ℃软蜡、52 ℃软蜡、56 ℃硬蜡各放置1 h。④切片：切去组织周围过多石蜡，固定于底座上，切片厚约5 μm，50 ℃水浴中展开后立即放入37 ℃烤箱中1 h。⑤脱蜡：二甲苯(Ⅰ)浸泡10 min，二甲苯(Ⅱ)浸泡5 min，100%(Ⅰ)、100%(Ⅱ)、95%(Ⅰ)、95%(Ⅱ)乙醇各浸泡5 min，85%乙醇浸泡3 min，75%乙醇浸泡2 min，蒸馏水冲洗1 min。⑥染色与脱水：苏木精染色5 min，自来水冲洗15 min；75%、85%乙醇各浸泡2 min，0.5%伊红染色1 min，95%(Ⅰ)、95%(Ⅱ)、100%(Ⅰ)、100%(Ⅱ)乙醇、二甲苯(Ⅰ)、二甲苯(Ⅱ)各浸泡5 min。⑦封片：在二甲苯尚未干透前，将中性树胶滴加于组织上，从一端逐步盖下盖玻片，室温保存。40倍光学显微镜下观察各组肝组织形态。

2 结果

2.1 大鼠体征、体质量变化 在为期4周的实验过程中，对照组大鼠生长情况良好，毛色光亮，活动量及进食量正常，表现活泼，对外界刺激反应灵敏。体质量基本稳步上升，喂养至最后1周，平均体质量较初时增重71 g。在前2周乙醇灌胃建模期间，模型组、熊果酸组和联苯双酯组大鼠均逐渐出现精神萎靡，活动量明显减少，行动迟缓，毛色略黄，伴少量掉毛，腹胀，食量下降，增重缓慢。后2周给药期间，熊果酸组和联苯双酯组大鼠生长情况有所好转，毛色日渐恢复光亮，掉毛量减少，活动量及进食量增多，行动、反应能力明显较前增强，腹胀逐渐消降，体质量升高幅度均较造模期间要高。熊果酸组和联苯双酯组大鼠平均体质量较初时分别增重50 g和36 g。而模型组大鼠生长情况无明显改善，行动、反应能力越发迟缓，腹部较前肿胀，体质量增幅缓慢，平均体质量较初时仅增重20 g(图1)。

图1 饲养期间各组大鼠体质量变化

2.2 大鼠给药后末梢FPG变化 在为期4周的实验过程中，对照组大鼠末梢FPG平稳，波动在4.8～5.1 mmol/L。在前2周乙醇灌胃建模期间，模型组、熊果酸组和联苯双酯组大鼠末梢FPG出现明显升高，且升高幅度基本一致。后2周给药期间，熊果酸组和联苯双酯组大鼠末梢FPG在给药后出现短暂平台期，之后均有所下降，波动在5.2～5.5 mmol/L。而模型组大鼠末梢FPG则持续升高，至喂养末期达到7.6 mmol/L(图2)。

图2 饲养期间各组大鼠末梢FPG变化

2.3 大鼠肝脏及病理切片表现 镜下观察各组大鼠的肝组织形态有明显差异。可见对照组大鼠肝小叶中央静脉周围有呈放射状排列的肝细胞包绕。肝板间有不规则的肝血窦，汇向中央静脉。肝小叶内的网状纤维结构完整，汇管区无明显胶原纤维存在，其周围无炎症细胞浸润。模型组大鼠的肝组织可见肝细胞排列紊乱，胞质肿胀，小叶周边部界板肝细胞的灶性坏死和崩解，汇管区扩大，有胶原沉积，胶原纤维延伸成纤维间隔，有淋巴细胞和单核细胞浸润。熊果酸组和联苯双酯组大鼠的肝脏组织相似，接近于对照组，肝小叶结构保持大致正常，未见明显纤维变性，汇管区无扩大，但有少量炎症细胞浸润。

2.4 熊果酸对大鼠血糖的影响 与对照组相比，模型组大鼠FPG升高(P<0.001)，血清FINS降低(P<0.001)，ISI降低(P<0.001)。熊果酸组及联苯双酯组大鼠FPG及血清FINS水平与对照组比较差异无统计学意义(P均>0.05)。熊果酸组及联苯双酯组与模型组比较，大鼠FPG水平下降(P均<0.001)，血清FINS水平升高(P均<0.001)，见表1。

2.5 熊果酸对大鼠肝功能的影响 与对照组相比，模型组大鼠ALT、AST、GGT、TG均升高(P均<0.005)。熊果酸组及联苯双酯组ALT、AST、GGT、TG水平接近对照组，差异无统计学意义(P均>0.05)。熊果酸组及联苯双酯组ALT、AST、GGT、TG水平与模型组比较差异有统计学意义(P均<0.05)，见表2。

表1 各组大鼠FPG、血清FINS、ISI比较(n=8,±s)

注：与对照组相比,aP<0.001；与模型组相比，bP<0.001。

表2 各组大鼠肝功能指标比较(n=8，±s)

注：与对照组相比,aP<0.001，bP<0.005；与模型组相比，cP<0.001。

2.6 各组大鼠SOD、MAD水平比较 与对照组相比，模型组SOD活性降低(P<0.05)，MDA含量升高(P<0.05)。熊果酸组及联苯双酯组SOD、MDA含量与对照组相比差异均无统计学意义(P均>0.05)。熊果酸组及联苯双酯组SOD、MDA含量与模型组相比差异有统计学意义(P均<0.001)，见表3。

表3 各组大鼠SOD、MAD水平比较 (n=8，±s)

注：与对照组相比，aP<0.05;与模型组相比,cP<0.001。

3 讨论

肝脏是人体内最大的消化腺，在病毒、化学物质、体内应激等因素的刺激下可导致肝脏损伤，其特点是肝实质细胞、血管内皮细胞产生炎症、坏死和凋亡，星状细胞和Kupffer细胞被激活并分泌促进肝脏纤维化的细胞外基质，在这一过程中可能引起肝脏内结构重建，严重者可使肝损伤持续，最终导致一系列肝脏疾病，如肝衰竭、肝硬化，直至肝癌。众所周知，肝脏是乙醇代谢的重要场所，长期饮酒或短时间大量饮酒可引起慢性或急性酒精性肝损伤[8]。有研究表明，急性酒精性肝损伤的病因主要是大量摄入乙醇后其代谢产物引起的脂质过氧化、炎症反应等[9]。酒精性肝损伤大致过程如下：在正常肝脏组织内存在的SOD、谷胱甘肽等物质构成肝脏的防御系统，具有抗氧化能力，摄入过量乙醇后肝脏的防御系统受到影响并抑制谷胱甘肽的合成，SOD的抗氧化能力被降低，肝脏细胞生化平衡被打破，从而导致如氧化应激、脂质过氧化等一系列反应，最终由于线粒体功能损伤、内质网应激反应及免疫炎症反应而引起肝脏功能障碍[10]。已知ROS信号通路介导的炎症氧化应激，与代谢综合征和糖尿病的发生有关[11]。而胰岛素抵抗反过来又能加重肝细胞损伤[12]。在胰岛素抵抗状态下，脂肪代谢的调节作用减弱，游离脂肪酸在血液中的含量随脂肪代谢能力的减弱而升高，随着大量游离脂肪酸进入肝脏，当超过肝脏细胞的承受能力时，会使肝脏细胞堆积大量脂质。同时在这一过程中会释放大量自由基，干扰线粒体正常功能，使游离脂肪酸的代谢变得更加缓慢，脂质蓄积增多，加重肝脏细胞的负担[13]。

MDA是生物体内膜质过氧化的重要代谢产物，自由基作用于脂质发生过氧化反应，氧化终产物为MDA，会引起蛋白质、核酸等生命大分子的交联聚合，且具有细胞毒性，其含量和脂质过氧化程度一致。因此MDA含量，间接反映机体细胞受损程度[14]。SOD是一种源于生命体的活性物质，能消除生物体在新陈代谢过程中产生的有害物质，能将有害的氧自由基转化为水，使受损的细胞得到修复，复原因自由基造成的对细胞伤害[15]。

机体摄入大量乙醇后会明显降低肝脏细胞内维生素A、维生素C、维生素E等抗氧化物质所需元素，从而降低SOD的活性，导致肝脏细胞内大量自由基积累并超过肝脏细胞的抗氧化酶代谢能力时，肝细胞膜会发生脂质过氧化反应，损害肝脏细胞功能[16]。联苯双酯可保护肝脏细胞生物膜的结构和功能，改善肝细胞的抗氧化能力，是我国创制的护肝药物，常用于治疗肝炎和肝损伤。

熊果酸是一种三萜类化合物，最早由日本学者从越桔叶中提取得来，可用于预防心脑血管疾病，改善肝功能等[7]。

ALT、AST和GGT是临床常用于评价肝功能受损的重要指标。本研究结果显示，大鼠经乙醇灌胃2周后，ALT、AST和GGT明显升高，提示肝实质细胞和毛细胆管受损，说明造模成功，TG、MDA升高，提示肝损伤后脂质积聚和代谢异常。大鼠出现FPG升高及FINS降低，SOD活性降低。石蜡切片可见肝实质细胞结构紊乱，炎症细胞浸润。经熊果酸治疗后，大鼠ALT、AST明显下降，肝功能明显改善，SOD活性升高，FINS水平升高，肝小叶结构大致恢复正常，仅有少量炎症细胞浸润，治疗效果与联苯双酯较为一致，接近对照组水平。以上结果提示，熊果酸能提高肝细胞应激水平，避免肝细胞进一步受损并促进肝功能恢复，此为今后酒精性肝损伤及其他肝病治疗提供了新思路。