乳酸菌干预对高脂血症大鼠营养物质代谢影响

黄玉军，姚瑶，戴颖，陈大卫，瓦云超，瞿恒贤，顾瑞霞

（扬州大学江苏乳品生物技术与安全控制重点实验室，江苏扬州225127）

0 引 言

随着生活水平的不断提高，我国的超重和肥胖人群日益增加。由超重和肥胖会造成血脂偏高，高血脂症对人类健康的危害已经不容忽视，高脂血症是诱发动脉粥样硬化等心脑血管疾病的主要原因之一，临床上通常用他汀类药物进行治疗，但药物副作用对人体伤害极大[1-4]。

目前，关于乳酸菌的研究发现乳酸菌对动物或人有很多有益作用，能作为膳食补充剂有效干预脂质代谢性疾病[5]、平衡肠道菌群、通过自身代谢产生多种消化酶、有机酸、营养物质等，直接或间接参与宿主营养物质代谢、吸收过程[6-9]等。近年来，益生菌干预心血管疾病是目前预防和临床研究热点。大量的人体和动物实验表明了拟杆菌、柔嫩梭菌、乳酸菌、双歧杆菌、肠球菌及肠杆菌等微生物在体内通过调节肠道菌群调节宿主的脂质代谢，具有降低血清中的血脂、胆固醇水平的功能。

本研究通过建立高脂血症大鼠模型，并用单一及混合乳酸菌进行干预，取其粪便、血清、胰腺及食糜进行指标检测，观察营养物质消化率、机体营养状况相关血清生化指标及胰肠消化酶的变化，探讨乳酸菌干预对大鼠营养物质消化吸收的作用规律。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验菌株

鼠李糖乳杆菌（L.rhamnosus grx10）和发酵乳杆菌（L. fermentum f5）由江苏省乳品生物技术与安全控制重点实验室分离筛选保藏。

1.1.2 实验动物及饲料

本实验使用的动物为160 g SPF 级的Wistar 雄性大鼠，购自扬州大学比较医学中心。在本院清洁级实验动物室内进行7 d 适应性喂养。饲料：高脂饲料（78.8%基础饲料、10%猪油、10%蛋黄粉、1%胆固醇、0.2%胆盐）购于南京协同生物工程有限公司。

1.1.3 主要实验仪器

全自动灭菌锅（日本TOMY 公司）、生化培养箱（上海新苗医疗器械制造有限公司）、高速冷冻离心机（美国塞默飞世尔科技有限公司）、电子天平（1/10000）（梅特勒-托利多仪器有限公司）、Bio-Tek ELX800 酶标仪（美国宝特公司）、全自动生化分析仪（日本Hitachi公司）。

1.1.4 药品与试剂

淀粉酶、胰蛋白酶、脂肪酶试剂盒（南京建成生物工程研究所）、TP、ALB、GLU、BUN 试剂盒（四川迈克生物科技有限公司）、无水乙醇（国药集团化学试剂有限公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 灌胃样品的制备

将活化三代后的菌株用PBS 缓冲溶液清洗并重悬制成菌悬液，调整其活菌数到109CFU/mL。

1.2.2 动物分组及处理

按各组间平均体重无显著差异重新分为5 组（n=15）对照组（NC）、高脂模型组（MC）、grx10 发酵液组（GF）、f5 发酵液组（FF）和混合发酵液组（HF）。对照组饲喂基础饲料，其余全部饲喂高脂饲料造高脂模型，饲养期间，每天计算进食量，每周称取体质量。从第3 周开始按体重计算灌胃量进行灌胃，GF 组灌胃2 mL/100g grx10 菌株发酵液，FF 组灌胃2 mL/100g f5菌株发酵液，HF 组灌胃2 mL/100g 混合菌株（grx10∶f5=1∶1）发酵液，MC 与NC 组灌胃2 mL/100g 生理盐水，连续灌胃4周。

1.2.3 测定指标和方法

1.2.3.1 蛋白质表观消化率及其他营养物质的消化率

最后一周进行消化代谢实验。从每组各取5 只，计算每只大鼠每日进食量，并进行粪便采样持续5天。采集的粪便先通过105 ℃烘干至恒重，然后碾碎过筛，测定粪样中的钙、粗脂肪、粗纤维以及粗蛋白质含量并与饲料中的含量计算得出各项营养物质的消化率。

参考GB/T 6432-2018[10]，凯氏定氮法测定粗蛋白质含量，采用Kjeltec 8400 全自动凯氏定氮仪测定；参考GB/T 6433-2006[11]，以索氏抽提法测定粗脂肪含量；采用GB/T 5009.10-2003[12]测定粗纤维的含量；采用GB/T 6436-2002[13]测定钙的含量。

营养素消化率=（该营养素摄入量-该营养素排泄量）/该营养素摄入量

1.2.3.2 血清生化指标

灌胃结束后将大鼠禁食12 h，眼球取血，离心取上部分血清，利用全自动生化分析仪测定血清总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLB)、血糖(GLU)、尿素氮(BUN)的含量。

1.2.3.3 消化酶活性指标

收集大鼠十二指肠和空肠前段的食糜，取下胰腺，放入-20 ℃冰箱中保存待测。测定前，拿出解冻，取0.2～0.3 g 样品混合9 倍体积（v/w）的冷却生理盐水制成匀浆液，4 ℃，4 000 r/min，20 min，取上清液测定胰腺和食糜中的淀粉酶、胰蛋白酶、脂肪酶活性。

1.2.4 数据处理

所有实验数据均通过统计软件（SPSS 16.0）进行统计学处理，均使用软件（Origin 2017）进行制图，各项指标结果以均数±标准差（x±sd）表示。

2 结果与分析

2.1 乳酸菌干预对大鼠蛋白质表观消化率及其他营养物质消化率的影响

有研究表明，乳酸菌干预对营养物质的消化吸收起积极作用，其作用机制有两种：一是分泌大量用于营养物质消化的消化酶；二是通过改变主要的营养物质吸收部位小肠的结构，使机体更易于营养的吸收[14]。代谢实验结果如图1所示。

图1 大鼠蛋白质表观消化率及其他营养物质消化率（n=5，x±sd）

分析上图可知，与NC 组相比，MC 组的粗纤维、粗脂肪和钙的消化率以及粗蛋白的表观消化率没有显著性变化（P＞0.05），说明高脂饮食对这几种营养物质的消化的影响不大；与MC 组相比，各干预组粗纤维、粗脂肪和钙的消化率均有显著性上升（P＜0.05），但对于前两者的消化组间差异并不明显，干预组的组间差异仅存在于钙的消化率上，HF 组与其他两组干预组相比，能显著提高大鼠的总钙消化率（P＜0.05），提示混合菌株发酵液干预有利于机体对钙元素的消化吸收；与MC 组相比，各干预组的粗蛋白表观消化率均有增长趋势，但变化无统计学意义（P＞0.05），其中对粗蛋白表观消化率最高的是HF 组；综合而言，乳酸菌干预有利于营养物质的消化，这与Lorek 等[15]和李新红等[16]的研究一致。

2.2 乳酸菌干预对大鼠血清生化指标的影响

从血清生化指标可大致了解机体营养物质代谢的情况[17]，本研究通过测定各受试组大鼠血清TP（总蛋白）、ALB（白蛋白）、GLB（球蛋白）及BUN（尿素氮）并计算白球比A/B，从与机体细胞合成与再生以及免疫功能相关的指标[18-20]进一步研究益生菌对高脂血症大鼠营养物质代谢及消化吸收的作用规律。结果如表1所示。

表1 大鼠血清生化指标（n=5，x±sd）

由表1 可知，与NC 组相比，MC 组的TP、GLB 、A/B 以及BUN 均有显著性变化（P＜0.05），提示饲喂高脂饲料对大鼠机体蛋白质的代谢和营养状况确实有影响，这与孔杰的研究一致[21]；与MC 相比，GF 组和FF 组GLB 和A/B 有显著性上升（P＜0.05），TP、BUN水平有显著性下降（P＜0.05），ALB 水平有所上升，但不显著（P＞0.05），提示乳酸菌干预可能有助于机体细胞再生和蛋白质合成与沉积，提高机体免疫功能，HF组仅GLB 水平和BUN 水平显著性变化，且对这两项指标的干预效果优于单一菌株干预，其余指标无显著性变化（P＞0.05），但有改善的趋势。

2.3 乳酸菌干预对大鼠消化酶活性的影响

消化酶主要是由胰腺分泌，且分泌量及分泌的酶活性受外界因素影响[22]。按照之前所述方法，测定各受试组大鼠胰腺内淀粉酶、脂肪酶及胰蛋白酶活性。结果如表2。

表2 大鼠胰腺消化酶活性（n=5，x±sd）

与NC 组相比，MC 组的胰腺消化酶活性无显著性变化（P＞0.05），说明高脂饮食对大鼠胰腺消化酶活性的影响不大；与MC 相比，各干预组胰腺淀粉酶活性均显著性下降（P＜0.05），说明乳酸菌干预后不利于胰腺中的淀粉酶发挥作用，各干预组的胰腺脂肪酶和胰蛋白酶活性的变化并不明显（P＞0.05），益生菌干预后，胰脂肪酶活性有下降趋势，胰蛋白酶活性有所上升，说明外源乳酸菌的摄入对这两种消化酶活性的影响不大，但总体来说，乳酸菌摄入后降低了胰腺消化酶的活性，此结果与蒋正宇[22]的研究结果一致，添加外源性消化酶会降低内源性消化酶的活性。

有研究表明，饲喂添加益生菌制剂的饲料后，有利于动物的成长，营养物质消化代谢，增强免疫力等[23-24]。大鼠解剖后取肠道中的食糜，测定肠道消化酶活性，结果如表3。

表3 大鼠肠道消化酶活性（n=5，x±sd）

分析数据可知，与NC 相比，MC 组的肠道淀粉酶和脂肪酶活性显著性下降（P＜0.05），胰蛋白酶活性的变化没有显著性（P＞0.05），说明高脂饮食对肠道淀粉酶和脂肪酶的影响较大；与MC 相比，FF 组与HF 组的肠道淀粉酶和脂肪酶活性显著上升（P＜0.05），提示乳酸菌的种类在对肠道淀粉酶的影响中起关键作用，而不是菌株的数量，其中HF 组的效果优于其余两组，说明益生菌干预对机体消化吸收淀粉和脂肪有积极作用；与MC 组相比，各干预组肠道胰蛋白酶活性有下降趋势，但差异无统计学意义（P＞0.05），提示不论是高脂饮食还是益生菌干预，对肠道胰蛋白活性的影响都不大，具体影响因素需进一步研究。

3 结 论

本实验通过先建立高脂血症大鼠模型，然后用单一及混合乳酸菌进行干预，对比各组数据可以发现乳酸菌干预均有助于增强高脂血症大鼠营养物质代谢及消化吸收，提高血清生化指标，加强蛋白质合成与沉淀，改善胰腺及肠道消化酶活性，其中单一乳酸菌干预对于血清生化指标的提高优于混合乳酸菌，但对于肠道淀粉酶和脂肪酶活性的改善效果低于混合乳酸菌，其余指标单一乳酸菌和混合乳酸菌的干预效果差异不大。