保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌及双歧杆菌共生关系和对搅拌型酸乳特性的影响

王茜，陈明君，王宝维,，葛文华，张名爱,，岳斌，李凯玲

（1.青岛农业大学 食品科学与工程学院，青岛266109；2.潍坊紫鸢乳业发展有限公司，山东 潍坊261045；3.国家水禽产业技术体系营养与饲料功能研究室，青岛266109）

0 引 言

酸乳在乳制品中占据了重要的位置[1]，搅拌型酸乳作为其中的一种，口味多样、营养丰富[2]，越来越受到大家的欢迎。保加利亚乳杆菌与嗜热链球菌是酸乳生产中常用的发酵剂[3]，传统酸乳主要使用二者混合发酵[4]。双歧杆菌属于革兰氏阳性杆菌，是最早发现的益生菌，维护着人类胃肠道的健康[5]，常洪美等[6]研究表明，保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、双歧杆菌三联活菌具有清除肠道大肠埃希菌（产超广谱β-内酰胺酶）的作用。研究保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌以及双歧杆菌混合发酵的最佳工艺，生产出人体可以直接吸收与利用的酸乳饮品，可以为保健型酸乳的开发探索一条新的途径，对人类健康具有重要意义。Sangita Bansal 等[7]以花生为原料，研制出一种益生菌酸乳，探究了培养温度、培养时间对酸度、黏度等方面的影响。Chipurura B 等[8]使用猴面包树果肉制备搅拌型酸乳，并对其进行口感、质地等进行了感官评定。另外，酸乳的质地受发酵剂菌种、热处理温度等方面的影响[9]，酸度、粘度是酸乳品质重要的衡量标准。目前，对于使用保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌以及双歧杆菌三者混合发酵的共生特性和对酸乳品质影响的研究较少，市场研发的类似产品还处于空白。本研究通过单因素试验和正交试验，研究保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌以及双歧杆菌3 个菌株的共生特性和对酸乳品质的影响，筛选出搅拌型酸乳最佳发酵工艺，旨在探明新型搅拌型酸乳工艺，为保健型酸乳新产品开发拓宽出新的途径。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

保加利亚乳杆菌（LB）、嗜热链球菌（ST）、双歧杆菌（B），丹尼斯克公司；原料乳，潍坊紫鸢乳业发展有限公司。

DNP-9162A 电热恒温培养箱，海贺德实验设备有限公司，JZH6000-40 均质机，上海锦竹机械设备有限公司，LDZX-50KBS 立式压力蒸汽灭菌器，上海申安医疗器械厂，NDJ-1 旋转式黏度计，青岛心成发展商贸有限公司，HSY2-SP 恒温水浴锅，龙口市电炉制造厂提供。

1.2 试验方法

1.2.1 发酵剂的制备

脱脂乳培养基制备∶将全脂奶粉充分搅拌溶解（全脂奶粉∶水重量比为1∶8），分别装入干燥的三角瓶和试管中，在灭菌锅中121 ℃灭菌15 min，冷却至43 ℃备用。

调制母发酵剂：将活化的菌种按全脂乳量2%～3%接种于装有灭菌全脂乳的三角瓶，充分混匀后，置于恒温箱中培养2.5 h，可供制备工作发酵剂。

1.2.2 单因素试验

1.2.2.1 单一菌种最佳接种量

将1%、2%、4%的LB、ST、B 分别接种于优质鲜奶中，42 ℃恒温箱中连续发酵8 h，记录酸度、黏度、口感的变化。

1.2.2.2 混合发酵最佳接种比例

将菌种按照接种比例LB∶ST∶B=1∶1∶1、1∶2∶1、2∶1∶1、1∶1∶2 进行接种，在42 ℃恒温箱中连续发酵8 h,记录酸度、黏度、口感的变化。

1.2.2.3 最佳发酵温度

按照比例LB∶ST∶B=1∶1∶2 接种，发酵温度分别为40 ℃、42 ℃和44 ℃，发酵8 h 每隔2 h 测一次酸度，记录酸度、黏度以及口感的变化。

1.2.2.4 最佳热处理温度

取100 g 鲜 奶，配 料 处 理 后，在85 ℃、90 ℃、95 ℃、100 ℃热处理温度下处理5 min 后分别进行酸度和黏度测定及感官评定。

1.2.2.5 最佳均质温度

取100 g 鲜 奶，配 料 处 理 后，在40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃温度下（均质压力为22 MPa）进行均质，然后分别进行酸度、黏度测定及感官评定。

1.2.3 正交实验

在以上单因素试验的基础上，选取发酵温度、热处理温度、均质温度三个因素进行正交试验，进而筛选出最佳工艺组合。采用L9（34）正交试验，因素水平表见表1。

表1 正交实验因素水平表

1.2.4 酸度测定[10]

取10 mL 乳样，滴加3 滴1%酚酞指示剂，混匀，用氢氧化钠标准溶液进行滴定，直至出现粉红色且30 s不退色。试验平行3 次。计算方法：酸度（°T）=氢氧化钠浓度×滴定所消耗的氢氧化钠标准溶液毫升数×100。

1.2.5 黏度测定[11]

通过NDJ—1旋转式黏度计进行测定。

1.2.6 感官评定

采用7 人（3 男4 女）组成评价小组，首先明确感官评定的指标以及注意事项，在实验前应避免吸烟、吃口香糖等行为，以减少感官评定的误差。评定结束后，收集所有评定表，进行统计。评定标准见表2。

表2 发酵乳的感官评价标准[12]

1.2.8 数据分析与统计

在该研究中，每个试验平行3次（n=3），结果以x±s表示，使用软件Origin8.6对试验结果进行分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果与分析

2.1.1 接种量对搅拌型酸乳品质的影响

（1）保加利亚乳杆菌的接种量对搅拌型酸乳品质的影响。

由图1 和图2 可知，接种量对酸度、黏度有较大的影响。接种量为1%时，由于接种量少，菌体生长缓慢，酸度、黏度相对较低，质地软，有轻度的流动，凝乳效果不佳，接种量为4%时，酸味强烈，乳清大量析出，接种量为2%时，感官评分最高。因此，保加利亚乳杆菌的最佳接种量为2%。

图1 不同接种量的保加利亚乳杆菌对各理化指标的影响

图2 不同接种量保加利亚乳杆菌对感官评分的影响

（2）嗜热链球菌的接种量对搅拌型酸乳品质的影响。

由图3 和图4 可知，接种量为1%时，由于接种量少，菌体生长缓慢，酸度、黏度较低，接种量为4%时，酸度、黏度偏大，4 h 后粘度无显著变化。接种量为1%时，酸味不佳，接种量为4%时，酸度、黏度较高，酸味强烈，有较大黏稠性，乳清大量析出，接种量为2%时，感官评分最高，因此，嗜热链球菌的最佳接种量为2%。

（3）双歧杆菌的接种量对搅拌型酸乳品质的影响。

由图5 和图6 可知，双歧杆菌在发酵后期，酸度、黏度开始增长。酸乳口感较差，酸味不理想，口感粗糙，接种量为2%时，感官评分最高。因此，双歧杆菌的最佳接种量为2%。

图3 不同接种量嗜热链球菌对各理化指标的影响

图4 不同接种量的嗜热链球菌对感官评分的影响

图5 不同接种量的双歧杆菌对各理化指标的影响

图6 不同接种量的双歧杆菌对感官评分的影响

2.1.2 不同菌种比例对搅拌型酸乳品质的影响

由图7 和图8 可知，酸度随着发酵时间的增长呈上升趋势，菌种比例为1∶2∶1 时，酸度、黏度最大。菌种比例为1∶1∶1 与1∶1∶2 时，酸乳感官评分较高，考虑到产品口感与生产成本，最佳的菌种比例为1∶1∶1。

图7 不同菌种比例对各理化指标的影响

图8 不同菌种比例对感官评分的影响

2.1.3 发酵温度对搅拌型酸乳品质的影响

由图9 和图10 可知，酸度随发酵时间的增加呈上升趋势，在2～4 h 时，酸度、黏度均快速增长，在4～10 h黏度无显著性变化。44 ℃发酵时，由于发酵温度较高，乳清大量析出，酸味浓郁，40 ℃发酵时，酸乳口感较差，42 ℃发酵时，酸乳组织细腻，状态均匀，有浓郁的奶香味，感官最佳。因此，最佳的发酵温度为42 ℃。

图9 不同发酵温度对各理化指标的影响

图10 不同发酵温度对感官评分的影响

2.1.4 热处理温度对搅拌型酸乳品质的影响

由图11 和图12 可知，酸度随热处理温度的提高而增加，在80～95 ℃，随着温度的不断增加，黏度呈上升趋势；在95～100 ℃，黏度呈下降趋势。在95 ℃时，感官评分达到最大值。因此，最佳的热处理温度为95 ℃。

2.1.5 均质温度对搅拌型酸乳品质的影响

由图13 和图14 可知，酸度随着均质温度的改变，无显著变化；在40～60 ℃，随着温度提高，黏度呈上升趋势，在60～80 ℃，黏度呈下降趋势，在60 ℃时，感官评分达到最大值。因此，最佳的均质温度为60 ℃。

图11 不同热处理温度对各理化指标的影响

图12 不同热处理温度对感官评分的影响

图13 不同均质温度对各理化指标的影响

图14 不同均质温度对感官评分的影响

2.2 正交试验结果与分析

在以上单因素试验的基础上，选取发酵温度、热处理温度、均质温度3 个因素进行正交试验，进而筛选出最佳工艺组合。采用L9（34）正交试验，每个因素设定3个水平。

根据R 值的大小可以得出本试验因素存在的显著性顺序，由表3 可知，感官评分的极差值RC＞RA＞RB，说明均质温度对酸乳的感官品质影响最大，发酵温度次之，热处理温度影响最小，最佳组合为A2B2C3，即LB、ST、B 混合发酵生产搅拌型酸乳时的最佳发酵温度为42 ℃，热处理温度为95 ℃，均质温度为60 ℃。

3 讨 论

3.1 单一菌种发酵与混合菌种发酵对酸乳品质的对比影响

本试验通过单一菌种发酵对酸度黏度变化的影响研究发现，ST 的产酸、产黏能力要强于LB 和B，B 产酸能力比较低，混合菌种发酵的产酸产黏能力、口感优于单一菌种，3 种菌互助合作，促进生长，具有协同关系。刘永吉等[13]使用嗜热链球菌、乳酸菌和双歧杆菌混合发酵，探究其对岗稔酸乳发酵品质的影响，研究结果表明，双歧杆菌不适合单独作为发酵剂使用，而应该结合嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌复配使用。李志成等[14]在对嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌的产黏产酸特性研究时得出，混合菌种的产酸产黏能力强于单一菌种。

3.2 发酵温度对酸乳品质的影响

本试验结果表明，不同的发酵温度对于菌种活力的影响是不同的，发酵温度越高，酸乳酸度越高，黏度呈上升趋势，对口感也有较大影响。李思宁等[15]在研究发酵温度对酸乳感官、风味等方面的影响时得出，温度波动使酸乳中的酮类物质增多，烃类物质明显减少，温度小范围波动对酸乳的凝乳时间、质构、感官影响不大。Sangita Bansal 等[16]对于益生菌大豆酸乳的发酵条件进行了优化，研究表明，发酵温度对于酸乳的理化性质有一定的影响，随着培养温度的变化，大豆酸乳酸度急剧增长。所以，发酵温度是影响酸乳发酵的一个重要的因素。

3.3 均质条件对酸乳品质的影响

本试验结果表明，均质温度对发酵酸乳的品质有很大影响。若均质温度过低，会导致酸乳的口感粗糙，脂肪上浮；若过高，会导致能耗增大，也无法改善产品质量[17]，所以要严格控制均质压力。Nguyen H T H 等[18]研究了均质化对水牛酸乳的结构特性的影响，结果表明，均质化可以减少乳清分离，最大限度的减少奶粉、稳定剂等的需要，改善了水牛酸乳的品质。

4 结 论

（1）保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌及双歧杆菌混合发酵能够改善酸乳的品质，3 种菌株协同发酵效果较好。

（2）最优发酵工艺条件为：菌种比例LB∶ST∶B=1∶1∶1，菌种接种量2%，发酵温度42 ℃，热处理温度95 ℃，均质温度60 ℃。