GC-MS比较三种发酵乳的挥发性化合物

李安，邢军，马龙，张瑞

（1. 新疆特殊环境物种保护与调控生物学实验室（自治区重点实验室），新疆师范大学生命科学学院，乌鲁木齐830054；2. 新疆大学生命科学与技术学院乌鲁木齐，830046）

0 引 言

开菲尔（Kefir）是高加索地区原产传统的酒精性发酵乳饮料，以牛乳为主要原料，添加含有乳酸菌和酵母菌的粒状发酵剂（开菲尔粒[1-2]），通过发酵而生产的具有酸味和气泡性的酒精性保健饮料[3]。新疆地区少数民族自古以来就有制作和食用发酵乳制品的习惯，传统的乳制品制作方法有着明显的地域性，做成的乳制品有着浓厚的地区特色和风味[3-4]。西藏灵菇酸奶则是通过西藏本地一种特有外形酷似白色的“菇”的复合菌种——西藏灵菇加入牛乳发酵制成。二者的制作工艺一般使用皮囊盛装牛乳或马乳，皮囊中蕴含着丰富的微生物种群，然而，不同地区的牧民甚至同一地区不同家庭的牧民在制作发酵乳制品时，使用的菌种也会有所不同，使其在发酵过程中形成具有浓郁地方特色的制品。经过几千年的驯化，这些传统乳制品中保留了许多具有传代性好，抗逆性强，风味浓郁独特的乳酸菌菌群[5-11]。传统的乳制品制作方法有着明显的地域性，浓厚的地区特色和风味，为发酵乳制品挥发性风味物质的研究开发提供了宝贵的资源[11]。

在工业生产中，乳制品的风味成分是值得关注的问题，发酵乳中的风味物质千差万别，种类繁多，并不是每种风味物质都对发酵乳的风味起决定性作用，这是因为各成分的含量不同，只有在其浓度超过阈值时才能被察觉并产生风味。因此风味物质的提取技术就很重要，静态顶空技术是指容器中一定量的液体或固体样品在一定的空间顶部，在一定的温度、压力、时间等条件下，收集热力学平衡态的上空气体的一种气体成分采集技术。该技术操作简便快捷，对气体成分采集较为全面，适宜于定性分析，进行定量测定时，还须考虑样品基体干扰问题[12-14]。

本实验采用顶空-气-质联用技术分析新疆地方特色发酵乳制品开菲尔、西藏灵菇发酵乳和两种发酵剂混合发酵乳的风味物质，对其进行定性半定量分析，意在了解三种酸奶中主要风味物质组成与特点。

1 材料与方法

1.1 原料

菌种，新疆玛纳斯县牧民传统家庭制作的发酵乳制品，再由实验室制备获得开菲尔粒。

西藏灵菇发酵剂。

牛奶，西域春牌纯牛奶。

1.2 仪器与设备

Agilent 7890A-5975C GC-MS 联用仪（USA Ag⁃ilent 公司），烘干箱，恒温箱等。

1.3 实验方法

1.3.1 样品的制备和培养

(1) 牛乳加热处理

将牛乳作为培养基质，采用80 ℃热处理20 min，备用。

(2) 发酵剂活化

开菲尔粒固态发酵剂→研磨粉碎→温水30 ℃泡洗3 次→按质量比1∶5接种在冷却至35～40 ℃的牛乳中→37±1 ℃培养24 h→过滤获得开菲尔粒→重复上述活化培养次数2-3 次→过滤获得发酵用开菲尔粒

将西藏灵菇依上述方法同样进行活化备用。

(3)接种发酵剂进行发酵培养

将活化后获得的两种发酵剂分别接种于已杀菌牛乳的发酵瓶中，置于27±1 ℃的恒温箱中培养，取发酵24 h 样品待测，同时将活化后的开菲尔粒与西藏灵菇1:1 比例混合后依上述培养过程进行发酵培养，取发酵24 h 样品待测，每种发酵乳取三个平行样进行测定。

1.3.2 静态顶空GC-MS测定条件

(1) GC条件：HP-INNOWax 毛细管色谱柱(0 ℃-265±5 ℃)∶(60m × 250 μm × 0.25 μm)；气化室温度:250 ℃；辅助加热器温度: 280 ℃；升温程序：起始温度50 ℃以10 ℃/min 升温到90 ℃，最后以4 ℃/min 升至240 ℃，保持20 min；载气：高纯He；流速：0.8 mL/min；分流比100∶1。

(2) MS 条件：电离方式：EI；电子能量70 eV；离子源温度：230 ℃；四级杆温度150 ℃；传输线温度：280 ℃；质量扫描范围m/z：50～500；全扫描；溶质延迟0 min；调谐文件为标准调谐。

(3) 顶空参数：7697 A (Agilent)，加热箱温度：150 ℃；定量环温度：170 ℃；传输线温度：180 ℃；样品平衡时间：40 min；进样持续时间：1 min；GC 循环时间：65 min；样品瓶体积：20 mL，样品量2 mL。

2 结果与分析

采用静态顶空富集3 种发酵乳中的挥发性风味物质，经GC-MS 分离检测。3 种发酵乳样品平行取样测定，得到色谱图如图1、2、3所示。

图1 新疆特色发酵乳制品开菲尔风味物质GC-MS色谱图

图2 开菲尔粒与西藏灵菇混合发酵乳风味物质GC-MS色谱图

图3 西藏灵菇发酵乳风味物质GC-MS色谱图

检索NIST 谱图库及未知物检测数据库，共定性107 种化合物，利用归一化法计算出挥发性风味物质在各发酵乳中的相对含量（见表1）。

2.1 挥发性风味物质鉴定结果

由表1 可知3 种发酵乳中挥发性风味成分主要包括酸类、酮醛类、呋喃类、醇类、酯类等6 大类。3 种发酵乳中的风味物质的含量差距很大，西藏灵菇发酵乳中环己烯酮为特有挥发性风味物质，开菲尔乳中脂类物质种类最多，使得3种酸奶各有各的风味特征。

2.2 挥发性成分种类的分析

2.2.1 醇类物质

醇类物质是酒精发酵，氨基酸转化降解的产物[12-16]，是反映发酵乳制品风味质量的重要指标，本次实验结果醇类共13 种，其中新疆特色开菲尔发酵乳中以麦芽糖醇，1-氯代-3,5-二甲基-1-己烯-4-醇作为主要的醇类风味物质，相对峰面积分别为4.55%和2.89%，而开菲尔粒-西藏灵菇发酵乳中醇类优势物为苯乙醇，相对峰面积50.18%，西藏灵菇发酵乳中1-氯代-3,5-二甲基-1-己烯-4-醇的相对峰面积达到31.04%。两者单独发酵时1-氯代-3,5-二甲基-1-己烯-4-醇在醇类物质中含量较多，二者混合发酵时醇类中的优势物发生改变。

2.2.2 酮醛类物质

表1 3种发酵乳风味物质GC-MS比较结果

（续表3）

（续表3）

醛酮类物质的香气阈值较低，酮类具有甜的焦糖香韵或者谷物香气，安息香醛具有苦杏仁的香味[12-16]。本次实验结果醛酮类物质共有17 种，其中2(5H)-呋喃酮为三种发酵乳共有的挥发性风味物质之一，在新疆特色开菲尔发酵乳与开菲尔粒-西藏灵菇混合发酵乳中3-糠醛是优势挥发性风味物质之一，相对峰面积分别为42.76%和74.75%。

2.2.3 有机酸类物质

本次实验检测出新疆特色开菲尔发酵乳有机酸类物质有9 种，己酸，十四酸，正癸酸等作为主要的风味物质。而混合发酵乳中苯甲酰亚甲基二乙酸以11.89%的相对峰面积在11 种有机酸类物质中表现为优势风味物质。西藏灵菇发酵乳中庚酸为主要酸类物质，相对峰面积21.44%。酸类物质一般在前发酵期产生，今后在酸奶的前发酵阶段，应加大优化调控力度，降低挥发酸产生量，将其控制在一个合理范围[12-16]。

2.2.4 酯类物质

酯类物质是一种良好的风味成分，是乳制品香气的重要组成成分之一[12-16]。本次实验结果共测得酯类物质有22 种，其中环丁酸,2-二甲基氨基乙基酯和2-丙烯酸,丁酯是西藏灵菇发酵乳中独有的风味物质，相对峰面积分别为10.04%和3.98%。新疆特色开菲尔发酵乳中油酸乙酯为主要的脂类物质贡献风味，其相对峰面积为15.2%。而混合发酵乳中的酯类物质以戊酸,2-羟基乙酯为优势风味物质，相对峰面积为7.58 %。

2.2.5 呋喃类物质

本次实验结果呋喃类物质共有4 种，其中西藏灵菇发酵乳中未检测到呋喃类风味物质。新疆特色开菲尔发酵乳与混合发酵乳中的呋喃类物质相对峰面积同样未超过1%，2-正丁基呋喃与3-甲基呋喃分别为两种乳制品中相对峰面积较大的风味物质，相对峰面积分别为0.18%和0.52%。呋喃类化合物是酸奶的重要风味物质之一，是反映酸奶风味质量的重要指标，牛奶和各种乳制品经过加热和贮藏，可产生各种呋喃类化合物。在加工过程中还原糖与含有游离氨基的化合物接触会发生美拉德反应，其产物经过相互作用，会生成呋喃与吡喃类化合物而产生嗅感[12-16]。

2.2.6 烷烃类物质

本次实验结果烷烃类物质共有15 种，其中西藏灵菇发酵乳中5 种，混合发酵乳中6 种，新疆特色开菲尔发酵乳中6 种。分析认为与风味物质关系不密切，可能是气相色谱柱加热后挥发成分，不作为特征风味成分。

2.2.7 其他类风味物质

包括1-[(1-氧-2-丙烯基)氧]-2,5-丁二酰亚胺，苯酚，N-(苄氧基)-2,2,2-三氟乙酰胺，4,5-二氢-3-甲基-1-丙基-1H-吡唑，甲基-2-氧-甲基-β-D-木吡喃糖苷，2-(1-甲基乙基)-噻吩，甲基N-(N-苄氧羰基-β-l-天门冬氨酰)-β-d-氨基葡糖苷等共20种。但这类风味物质均应在低浓度才能发挥其香气的正面促进作用，是异型乳酸发酵菌发酵的微量产物[12-16]。

3 结论及讨论

3.1 结论

通过GC-MS 分析，3 种发酵乳中主要有6 类挥发性风味物质，主要包括：醇类、酮醛类、有机酸类、呋喃，酯类和烃类。而新疆特色发酵乳制品开菲尔中主要包括15 种酯类，11 种醇类，9 种有机酸类，6 种烃类，3 种呋喃类，10 种酮醛类；西藏灵菇乳中主要包括2 种酯类，2 种醇类，2 种有机酸类，5 种烃类，4 种酮醛类；开菲尔粒-西藏灵菇混合发酵乳中主要风味物质有酯类7 种，醇类5 种，11 种有机酸类，6 种烃类，2 种呋喃类，9 种酮醛类。其中新疆特色发酵乳制品开菲尔中以麦芽糖醇、3-糠醛、油酸乙酯、十四酸，己酸，正癸酸等为优势风味物质，西藏灵菇发酵乳中以环丁酸,2-二甲基氨基乙基酯，1-氯代-3,5-二甲基-1-己烯-4-醇，庚酸，顺-5,8,11,14,17-十二碳五烯酸，4,4-二甲基-2-甲基环戊烯醇酮-1-酮等为主要风味物质，开菲尔粒-西藏灵菇混合发酵乳中主要风味物质为3-糠醛，苯甲酰亚甲基二乙酸，戊酸，庚酸，辛酸，苯乙醇等。为今后研究新疆地方特色发酵乳制品开菲尔中的挥发性风味物质指纹图谱提供参考依据。

应用顶空-气相色谱-质谱联用技术对具有地方特色发酵乳制品中的挥发性风味物质进行了分析，结果表明此方法快速便捷，可以对具有地方特色发酵乳制品中的挥发性风味物质的成分含量进行有效的分析。

3.2 讨论

由表2 可知不同地区的发酵乳制品中的挥发性风味成分也存在着一定的区别。与赛里木原籍菌种发酵乳[12]和川西牧区传统发酵酸奶[16]中的挥发性成分相比，新疆地方特色发酵乳制品开菲尔中的挥发性成分种类多，其中醇类含量最高，3-糠醛、油酸乙酯、己酸、正癸酸等为优势风味物质。在这里产生区别的主要原因是与发酵剂菌种的来源，当地微生物群落特点，品种及当地的发酵工艺有关。

表2 3种发酵乳制品主要挥发性风味成分的比较

3 种发酵乳中风味物质成分相较下新疆地方特色发酵乳制品开菲尔中挥发性成分种类较多，将开菲尔粒与西藏灵菇混合之后，发酵乳风味物质明显增加，优势风味物质也由1-氯代-3,5-二甲基-1-己烯-4-醇变为3-糠醛。新疆特色发酵乳制品开菲尔具有更良好的风味，而将开菲尔粒作为发酵剂添加至乳中或与其它发酵剂混合发酵，也能在更大程度上改善和提高发酵乳制品风味。