上海地区生鲜乳中金黄色葡萄球菌分离及耐药性研究

孙冰清，姜芹，张妤，顾欣，张文刚

（上海市兽药饲料检测所上海201103）

0 引 言

金黄色葡萄球菌作为最常见的食源性致病菌，是引起奶牛乳房炎的主要病原，也是造成人类食物中毒的常见病原之一[1]。生鲜乳中分离的金葡菌能够反映养殖场的养殖环境、奶牛健康状况、挤奶及运输过程的微生物控制等情况。目前奶牛乳房炎的治疗主要依靠抗菌药物，大量抗菌药物的不合理使用导致金黄色葡萄球菌耐药性增加，甚至出现MRSA、VRSA 等超级细菌。

为了解上海地区生鲜乳中金黄色葡萄球菌污染情况，本课题拟对上海地区生鲜乳中的金黄色葡萄球菌进行分离鉴定，并对分离得到的金黄色葡萄球菌进行18 种常见抗菌药物耐药性检测，以掌握近年来上海地区生鲜乳中金黄色葡萄球菌耐药情况。本研究可为从源头了解和把控上海地区生鲜乳的品质提供技术支撑，也可为临床合理用药提供参考依据，对生鲜乳质量控制与安全预警具有重要的意义。

1 实 验

1.1 材料

7.5 %氯化钠肉汤、Baird-Parker（B-P）琼脂培养基、胰酪大豆胨琼脂培养基（TSA）、MH 肉汤、0.9%生理盐水、VITEK 2 革兰氏阳性菌鉴定卡、金黄色葡萄球菌标准菌株ATCC29213、冻干型革兰氏阳性菌药敏板，内含庆大霉素GM、阿莫西林/克拉维酸AMC、苯唑西林OX、青霉素PEN、头孢噻呋EFT、恩诺沙星ENR、复方新诺明SXT、万古霉素VA、克林霉素CLI、红霉素E、替米考星TIL、氟苯尼考EFC、泰妙菌素TIA、磺胺异恶唑SF、头孢西丁FOX、氧氟沙星OFX、多西环素DO、利奈唑胺LNZ18 种抗菌药物，上海星佰生物技术有限公司。

1.2 设备

VITEK 2 Compact 全自动微生物鉴定系统、革兰氏阳性细菌鉴定卡，法国梅里埃；浊度仪、Sensititre AIM 全自动菌液接种仪，Thermo。

1.3 方法

1.3.1 金黄色葡萄球菌分离与纯化

2016-2018 年在上海市各奶站采集生鲜乳样品共计548 份，采样点基本覆盖上海及周边地区奶牛场。取1 mL 生鲜乳样品至9 mL 7.5%氯化钠肉汤中，振荡混匀，置于36 ℃恒温培养箱中进行增菌培养24 h。取增菌培养物划线接种至Baird-Parker琼脂培养基上，36 ℃培养24 h。挑取灰黑色至黑色菌落接种至Baird-Parker 琼脂培养基进行纯化一代，纯化后的可疑金黄色葡萄球菌落接种至TSA 平板，36 ℃培养18 h，待鉴定。

1.3.2 金黄色葡萄球菌鉴定与保存

使用全自动微生物鉴定系统VITEK 2 Compact对纯化得到的可疑菌落进行生化鉴定，选择革兰氏阳性菌鉴定卡片（GP），根据仪器使用说明进行操作。鉴定为阳性的菌种保存至-80 ℃冰箱。

1.3.3 金黄色葡萄球菌抗菌药物敏感性测试

将分离到金黄色葡萄球菌接种至TSA 培养基上，36 ℃培养18 h，挑取2～3 个新鲜培养的单菌落，置3 mL 灭菌生理盐水中，使用比浊仪将细菌浓度调整至0.48～0.56 麦氏单位，使菌液的细菌含量约为1×108CFU/mL，随后进行100 倍稀释，接种于含不同药物浓度的96 孔冻干型细菌药敏板中，置36±1 ℃培养箱中培养18 h，使用金黄色葡萄球菌标准菌株ATCC 29213进行质量控制。

1.3.4 结果判读

自培养箱中取出药敏板，置于衬有黑底板的光线下肉眼观察结果。依据美国临床实验室标准化委员会CLSI 的相应标准对抗菌药物敏感性结果进行判读，如表1 所示。药敏板上阴性对照孔内无细菌生长，液体未见浑浊；阳性对照孔内有细菌生长，液体浑浊，且质控菌株的MIC 值在规定的范围内，则药敏板结果有效。

2 结 果

2.1 金黄色葡萄球菌的分离鉴定

548 份生鲜乳样品中共分离出256 株金黄色葡萄球菌，每年生鲜乳采样量及金黄色葡萄球菌分离株数见表2。金黄色葡萄球菌三年的平均分离率为46.2%，2016-2018 年菌株分离率呈逐年上升趋势，趋势图见图1。

表2 2016-2018年金黄色葡萄球菌分离情况

图1 2016-2018年金黄色葡萄球菌分离率

2.2 金黄色葡萄球菌对18种常见抗菌药物敏感性分析

由药敏试验结果可知，256 株动物源金黄色葡萄球菌对青霉素（96.8%）和磺胺异噁唑（94.2%）的耐药率较高，对其余16 种抗菌药物的耐药率均低于30%，对万古霉素的耐药率为零。多重耐药主要集中在3-4耐，占比37.5%，见图2。

2.3 MRSA 分离率

根据金黄色葡萄球菌对苯唑西林的耐药情况，从256株金黄色葡萄球菌中分离出15株耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA），MRSA 平均分离率达5.9%，通过对比2016-2018 三年的MRSA 分离率发现，自2016年开始，MRSA 的分离率呈逐年上升趋势，见图3。

图2 256株金黄色葡萄球菌对18种抗菌药物耐药率

表3 256株金黄色葡萄球菌对13类抗菌药物多重耐药率

图3 2016-2018年MRSA分离率

3 讨 论

金黄色葡萄球菌是一种常见的、引起细菌性食物中的食源性致病菌，属于葡萄球菌属，拥有“嗜肉菌”的别称，在人类生活环境中广泛存在，它同时是奶牛乳房炎的主要病原菌。奶牛生鲜乳中的金黄色葡萄球菌的污染状况能够反映生鲜乳生产链、运输链的卫生控制并直接影响生鲜乳的品质。

2016-2018 年从上海各个奶牛场采集的548 份生鲜乳样品中，共有256 个样品分离出金黄色葡萄球菌，金黄色葡萄球菌总分离率为46.2%，近三年分离率呈上升趋势。研究报道我国生鲜乳中金黄色葡萄球菌的分离率存在着有明显的地区差异，山东地区分离率为44%～64%[2]、北京地区49.38%[3]、广东45%[3]、新疆乌鲁木齐市33.7%[4]、西宁22.4%[5]。薛秀恒等研究发现，安徽省30 个奶站中有4 个地区奶站的牛奶中污染金黄色葡萄球菌，从污染的牛奶中共分离出5 株金黄色葡萄球菌，检出率为16.7%[6]，其结果远低于本研究结果，这有可能与采样方式和采样时间不同有关。而在世界范围内，金黄色葡萄球菌在生鲜乳中的分离率存在国家及地区差异，分离率在12%～79%不等[7]。由于本研究采样时间为夏季，天气炎热，生鲜乳相较于其他季节更容易发生变质，细菌更容易大量繁殖，在后续研究中应尽可能增加其他季节的采样与研究，更全面真实的反映上海地区生鲜乳中金黄色葡萄球菌的污染状况。

根据抗菌药物敏感性试验结果，256 株金黄色葡萄球菌对18 种抗菌药物存在不同程度的耐药，对青霉素的耐药率最高，达到96.9%，该结果接近北京地区食源性金黄色葡萄球菌对青霉素的耐药率（99%）[8]。其次为磺胺异噁唑，耐药率为94.1%。受试菌对其中11种抗生素的耐药率低于10%，提示这些药物可作为优先选择的抗生素用于治疗乳源金黄色葡萄球菌引起的疾病。近年来我国报道的MRSA 越来越多，本研究中总计分离到15 株MRSA，分离率为5.9%，总体上呈逐年增长的趋势。这些MRSA 在后续应开展相关研究。

根据研究结果得知，上海生鲜乳中金黄色葡萄球菌污染程度较为严重，建议养殖场在日常管理过程中加强清洁消毒工作，挤奶和运输环节尽可能避免人为的交叉感染，及时发现并治疗患病奶牛，科学合适的使用抗菌药物。