孕期及哺乳期苯并[a]芘暴露与子代胰腺受损及mtDNA拷贝数的关系

夏力旦·阿力甫 鲁 英 崔 蓉

多环芳烃(polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs)是一类广泛存在于环境中的持久性有机污染物。有研究发现，PAHs暴露可能与糖尿病的发生有关[1]。环境污染物暴露导致mtDNA拷贝数的异常变化，并且与机体多种不良结局有相关性，如心血管疾病和糖尿病等[2，3]。胎儿对多环芳烃引起的DNA损伤程度可能比母亲敏感10倍且可能会引发成人期的慢性疾病[4]。

本研究用PAHs的典型代表苯并[a]芘{benzo[a]pyrene，BaP}染毒，观察不同剂量BaP染毒后，Wistar母鼠及子代血糖及mtDNA拷贝数差异性，为进一步探索孕期BaP暴露与子代糖代谢的关联性提供依据。

材料与方法

1.试剂及仪器：纯度为99.0%的苯并[a]芘(德国 Dr.Ehrenstorfer 公司)、水合氯醛(天津福晨化学试剂有限公司)、血糖仪(江苏鱼跃医疗设备股份有限公司)、ELISA试剂盒(上海江莱生物科技有限公司)、全自动石蜡包埋机及切片机(德国徕卡仪器有限公司)、组织基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技公司)、分光光度计(美国赛默飞世尔科技公司)、荧光定量PCR仪(美国赛默飞世尔科技公司)。

2.实验对象：SPF(specific pathogen free)级健康未生育Wistar雌鼠24只，平均体质量为213.20±9.57g。雄鼠8只，平均体质量为211.10±8.85g。由新疆医科大学医学实验动物中心提供，实验动物许可证号：SCXK(新)2018-0002。动物研究遵循了新疆医科大学医学实验动物中心有关实验动物管理和使用规定并通过了伦理审批，伦理审批号：20190226-30。

3.动物交配：适应期饲养1周，第8天晚8:00时按照雄雌1∶3比例进行合笼，次日晨用棉棒以0.9%NaCl溶液在阴道口缓慢插入雌鼠的阴道，取内容物，均匀涂抹载玻片，放置于光学显微镜下观察，两名操作者分别核查，均发现精子者判定为受孕，记为妊娠第1天。

4.动物分组及染毒：排除未受孕的大鼠，将已受孕母鼠按体质量随机分为对照组，BaP低(2μg/kg)、中(200μg/kg)、高(800μg/kg)剂量组，每组6只孕鼠。孕鼠BaP灌胃染毒至哺乳期结束时(孕期21天，哺乳期21天，共6周)，排除体质量差异性较大子鼠，剩余子鼠随机选其1只确定为本实验研究对象。每组6只与母鼠相配对子鼠，共24只。以上确定的子鼠在出生第21天断乳后(PND21)与母鼠同时、同步进行下一步实验。BaP染毒剂量根据世界卫生组织发布的孕产妇多环芳烃接触限量以及美国环保署等得出的呼吸道暴露BaP致癌剂量设定[5,6]。称取一定量的BaP,溶解于玉米油中并4℃超声30min制成一定浓度的BaP 原液，使用时按照剂量，用玉米油进行稀释。BaP暴露从孕期开始至哺乳期结束(6周)每天灌胃1次，对照组暴露同等剂量的玉米油。染毒期间自由饮水。

表1 引物序列

结 果

1.大鼠一般情况:与对照组比较，高、中剂量组母鼠饮水量、进食量明显减少，毛发干枯，精神状态不佳。低剂量组母鼠与高、中剂量组比较，精神状态较好，饮水量、进食量正常。对照组母鼠生长良好，饮水、进食及活动均正常。

2.BaP暴露与母鼠及子鼠脏器系数的变化：实验得出，染毒组母鼠胰腺脏器系数均高于对照组，其中低剂量组母鼠胰腺脏器系数与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。随着染毒剂量增加，高剂量组子鼠胰腺脏器系数均高于中、低剂量组及对照组(P<0.05)，详见表2。

表2 各组大鼠脏器系数的比较

3.母鼠不同时间点空腹血糖的变化：中、高剂量组母鼠PND10及PND21空腹血糖值显著高于GD1的空腹血糖值(P<0.05)，详见表3。

4.母鼠断乳期空腹血糖、胰岛素、胰岛素相关指数的比较：哺乳期第21天，各组母鼠空腹血糖值、胰岛素含量及HOMA指数，经统计学检验组间比较,差异无统计学意义(P>0.05)，详见表4。

5.子鼠断乳期空腹血糖、胰岛素、胰岛素相关指数的比较：子鼠胰岛素水平中、高剂量组分别与对照组比较,差异有统计学意义(P< 0.05)，且对照组显著低于高剂量组，详见表5。

6.BaP暴露对子代胰腺组织形态的影响：子鼠胰腺HE染色结果显示，高剂量组胰岛边界模糊，胰岛内β细胞排列稀疏，细胞明显减少，可见空泡变性及凋亡细胞，部分胰岛细胞内脂质沉积。中剂量组胰岛β细胞肿胀，同样可见空泡变性。低剂量组胰岛相对完整，胰岛边界较清晰，β细胞形态较好。对照组胰岛边界清晰，胰岛内β细胞分布均匀，胞质丰富，胰岛细胞间毛细血管丰富红染(图1)。

图1 孕期BaP暴露对子鼠胰腺形态的影响(HE，×400)A.高剂量组:胰岛边界模糊，胰岛内β细胞排列稀疏，如短箭头所示可见空泡变性，三角形所示可见细胞内脂质沉积;B.中剂量组:胰岛内β细胞排列稀疏，如短箭头所示可见空泡变性;C.低剂量组：胰岛相对完整，胰岛边界清晰，β细胞数目增加，细胞形态较好，无明显的空泡变性、肿胀及脂质沉淀; D.对照组: 胰岛呈椭圆形团索状，胰岛边界清晰，β细胞分布均匀、 排列紧密，如长箭头所示可见胰岛细胞间毛细血管丰富红染

7.母鼠及子鼠胰腺组织 mtDNA 拷贝数组间差异性分析：通过RT-PCR定量技术得出，母鼠胰腺组织平均mtDNA拷贝数组间比较，差异无统计学意义。子鼠高剂量组胰腺组织平均mtDNA拷贝数与其余3组比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。对照组胰腺组织平均mtDNA拷贝数为405.04±287.72，高剂量组平均mtDNA拷贝数为68.30±13.02,对照组是高剂量组的5.96倍，详见图2。

图2 母鼠及子鼠胰腺mtDNA拷贝数与高剂量组比较，*P<0.05

讨 论

研究表明，长期接触多环芳烃与肥胖和2型糖尿病有关联性[7,8]。BaP是毒性不良反应最强的多环芳烃之一，其接触途径有摄入BaP含量高的食物和呼吸道吸入[9]。高脂饮食时摄入BaP通过诱导促进2型糖尿病相关基因的表达而增加2型糖尿病的发生风险[10]。2型糖尿病的早期阶段，胰腺β细胞通过胰岛素的高分泌进行补偿，以维持正常的血糖水平[11]。然而，由于线粒体功能紊乱，β细胞代偿功能失调，进而导致β细胞凋亡[12]。本研究中，中、高剂量组母鼠均有不同程度体质量减轻现象。随着实验的进行，染毒组母鼠及子鼠胰腺脏器指数亦随之升高，提示大鼠的胰腺可能发生了一定程度的损伤。

本实验检测了大鼠的血糖、胰岛素以及HOMA指数。空腹血糖作为检测糖尿病的“金标准”，反映胰岛素分泌以及胰岛β细胞功能[13]。HOMA指数已被广泛应用于机体胰岛素敏感度、胰岛素抵抗水平与胰岛β细胞功能的评价[14]。本研究中，中、高剂量组母鼠PND10及PND21的空腹血糖值显著高于GD1的空腹血糖值,然而, HOMA指数组间比较，差异无统计学意义，这可能与大鼠个体差异较大或因样本量较小有关。

研究显示，胰岛 β 细胞功能具有很强的遗传性[15]。Simmons等[16]提出大鼠胰腺类似与人类胰腺，胎儿胰腺发育对妊娠期宫内葡萄糖水平十分敏感，故宫内不良环境可使子代胰腺发育受损，且这种效应可延续至成年。在本研究中，高剂量组子鼠胰岛素水平显著高于对照组。胰腺HE染色结果中，随着染毒剂量的增加子代胰腺胰岛边界模糊，胰岛内β细胞排列稀疏，细胞明显减少，可见空泡变性且部分胰岛细胞内脂质沉积。结合不同组间子鼠胰岛素水平差异性以及胰岛细胞数目及形态的改变，提示孕期BaP暴露对子代β细胞胰岛功能有一定的影响。

线粒体在能量代谢、活性氧自由基生成等方面发挥着重要作用。线粒体遗传信息只能通过母亲遗传给后代[17]。相对于核DNA,mtDNA 缺少染色质结构和组蛋白的保护并且DNA修复能力的不足，易受环境污染物影响，导致mtDNA 的突变与缺失[18]。McCarthy等[19]在非胰岛素依赖性糖尿病人群中检测出mtDNA ND1 G3316A突变。Hirai等[20]研究发现，mtDNA ND1 T3394C突变在日本糖尿病人群中高发。在大学生和亲自做饭的妇女中，PAHs暴露与其mtDNA拷贝数呈负相关[21，22]。但在焦炉工人中，PAHs 暴露与mtDNA拷贝数却呈正相关[23]。

综上所述，本实验以mtDNA ND1基因为切入点发现，随着BaP暴露浓度的增加子鼠胰腺组织平均mtDNA拷贝数降低，且对照组平均mtDNA拷贝数为高剂量组的5.96倍。本研究结果为孕期BaP暴露与子代胰腺组织mtDNA拷贝数的变化之间的联系提供了证据，其子代mtDNA拷贝数的减少可能是孕期BaP暴露导致2型糖尿病发生的重要原因之一。鉴于人类与其他哺乳动物有着许多共同的生物特性，认为表突变可能也会在人类中一代代地遗传下去似乎是合理的。本研究也存在不足之处，因本研究染毒周期为孕期开始至断乳期，只针对 21 天龄的子鼠进行了孕期及哺乳期BaP暴露与糖脂代谢分子机制相关研究。今后可进一步研究子代成年期糖脂代谢的情况，使研究结果更具有代表性。