柴胡皂苷-d对H2O2诱导的HL-7702细胞ROS产生及NLRP3炎症体的影响①

周蒙恩 张 娜 阙任烨 林柳兵 李 勇 （上海中医药大学附属市中医医院脾胃病科，上海200071）

肝脏是人体重要的消化器官，肝细胞是控制系统代谢需求、电解质稳态和肝脏解毒过程的中央调节器［1-2］。急性肝损伤（acute liver injury，ALI）是一种多因素复杂的炎症性疾病，报告表明病毒感染、药物滥用、酒精中毒、食物中毒和辐射损害等均可导致ALI［3］。由于细胞、组织和功能破坏的增加，广泛或持续的肝损伤可能导致肝衰竭或肝硬化，并与高死亡率相关［4］。肝损伤的治疗仍然是当代医学最具挑战性的问题之一，需要开发治疗ALI 的新疗法［5］。柴胡已在治疗肝脏疾病中应用，柴胡皂苷-d（saiko‐saponin d，SSd）是柴胡的主要活性成分之一，具有抗炎、保肝、抗肿瘤、抗氧化应激、抗纤维化的作用［6］。前期实验研究表明SSd 可以抑制细胞氧化应激和NLRP3 炎症小体活化减轻ALI，但是ROS 的来源及NLRP3活化的机制尚不清楚［7］。本文通过H2O2诱导HL-7702 细胞氧化应激，探讨 SSd 对线粒体 ROS 的产生及NLRP3炎症体表达的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 人肝细胞系HL-7702 由上海中医药大学中药研究所惠赠；SSd 购自上海源叶生物科技有限公司；MitoTEMPOL 购自翌圣生物科技（上海）有限公司；H2O2、DMEM 培养基购自上海亿凡生物科技有限公司；胎牛血清购自美国Gibco 公司；NLRP3抗体购自美国Cell Signaling Technology 公司；ASC抗体、Caspase1 抗体购自美国Novus Biologicals 公司；β-actin 抗体、BCA 蛋白浓度测定试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；RT-PCR 引物购自上海生工生物工程有限公司；线粒体膜电位（JC-1）、ATP、ROS 检测试剂盒购自碧云天生物技术公司；多功能酶标仪Varioscan Flash 购自上海百基生物科技有限公司；天能电泳仪EPS300购自上海天能科技有限公司；光学显微镜（AE41）购自麦克奥迪实业集团有限公司；Nanodrop2000 购自美国赛默飞世尔科技公司；S1000 PCR仪购自美国Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 HL-7702细胞培养于含10%FBS的DMEM 培养基，恒温37℃，体积分数为5%CO2，每48 h 更换培养基。细胞生长铺满培养瓶底约80%后，用0.25%的胰蛋白酶（含EDTA）消化传代。将细胞悬液（2×105个/孔）接种于6 孔板。分组为H2O2模型组：200 μmo/lL H2O2作用 HL-7702 细胞 4 h 诱导细胞增殖活化；MitoTEMPOL+H2O2组：50 μmo/lL MitoTEMPOL 作 用 HL-7702 细 胞 24 h 后 ，加 入200 μmo/lL H2O2作用4 h；SSd+H2O2组：SSd作用HL-7702细胞24 h后，加入200 μmo/lL H2O2作用4 h。

1.2.2 JC-1检测 药物干预HL-7702细胞后，除去培养液，使用PBS 缓冲液洗涤细胞1 次，加入1 ml细胞培养液及JC-1 染色工作液（阳性对照组加入CCCP 溶液），37℃ 孵育20 min 后，吸除上清，用JC-1染色缓冲液洗涤2 次，再加入细胞培养液2 m/l孔，荧光显微镜下观察。

1.2.3 ATP 检测 药物干预HL-7702细胞后，除去培养液，加入裂解液，离心取上清，用ATP 检测试剂稀释液稀释ATP 检测试剂，4℃保存。用ATP 检测裂解液将 ATP 标准溶液按照 0.01、0.03、0.1、0.3、1、3和10 μmo/lL的浓度梯度依次稀释，制作标准曲线。加100 μl ATP 检测工作液到检测孔内，室温放置5 min，消耗本底性的ATP。在检测孔内加上20 μl样品或标准品，迅速混匀，用化学发光仪进行测定。

1.2.4 细胞内ROS 检测 将药物干预后的HL-7702 细胞，使用PBS 缓冲液充分洗涤后，收集于稀释好的DCFH-DA 中，37℃孵育20 min，期间每隔3~5 min混匀，使探针和细胞充分接触。用无血清细胞培养液洗涤细胞3 次，分别用活性氧阳性对照刺激细胞30 min、H2O2刺激细胞4 h 同步完成，荧光酶标仪检测。

1.2.5 Western blot 检测 NLRP3、ASC、Caspase1 炎症体表达 使用RIPA 裂解液提取各组细胞蛋白，BCA 蛋白试剂盒检测蛋白含量。细胞蛋白经变性后，以SDS-PAGE 凝胶进行电泳分离胶分离蛋白，并转移至PVDF 膜，经5%的脱脂奶粉摇床上慢摇2 h封闭后，除去封闭液，用TBST 漂洗，加入NLRP3 抗体、ASC 抗体、Caspase1 抗体 4℃ 过夜孵育，回收一抗，用 TBST 漂洗，室温孵育二抗 2 h，用 TBST 漂洗后，进行ECL 光化学显色。最后应用Image J 分析软件对扫描条带进行定量分析，计算各蛋白相对表达量。

1.2.6 RT-PCR 检测 NLRP3、ASC、Caspase1 炎症体表达 采用TRIzol 试剂提取总RNA，Nanodrop2000检测 RNA 的纯度和浓度，各组取 2 μl 总 RNA，按20 μl 总反应体积，反转录为cDNA，然后以cDNA 为模板分别进行PCR 扩增，NLRP3 上游引物5'-TT‐GACTTCCGCAAGGACCTCGG-3'，下游引物 5'-GC‐GCCCGGGTTATGCTGCTGGT-3'，ASC 上游引物 5'-GGCTGCTGGATGCTCTGTA-3'，下游引物 5'-AGGCTGGTGTGAAACTGAAGA-3'，Caspase1 上游引物 5'-CAGACAAGGGTGCTGAACAA-3'，下游引物 5'-TC‐GGAATAACGGAGTCAATCA-3'，β-actin 上游引物5'-CTCCATCCTGGCCTCGCTGT-3'，下游引物5'-GCTGTCACCTTCACCGTTCC-3'，采用三步法进行PCR扩增，反应结束后，得到各样本Ct值，然后利用2-ΔΔCt计算各组基因的相对表达量。

1.3 统计学处理 采用SPSS22.0 软件、Image J、GraphPad5.0软件进行统计分析、作图，数据采用表示，组间比较采用单因素方差分析（one-way ANO‐VA），均采用双侧检验，P<0.05 表示差异有统计意义。

2 结果

2.1 SSd 对H2O2诱导的HL-7702 细胞线粒体功能的影响

2.1.1 SSd 对 H2O2诱导的 HL-7702 细胞 JC-1 的影响 与对照组相比，H2O2作用于HL-7702细胞，线粒体膜电位明显降低，差异有统计学意义（P<0.01）；MitoTEMPOL、SSd 干预后，与 H2O2组相比，线粒体膜电位明显上升，差异有统计学意义（P<0.01）。H2O2对HL-7702的氧化应激损伤使线粒体膜电位有下降趋势，MitoTEMPOL、SSd 干预后抑制了 H2O2对 HL-7702细胞线粒体膜电位的下调。见图1。

图1 MitoTEMPOL、SSd 对 H2O2 诱导 HL-7702 细胞 JC-1的影响Fig.1 Effect of MitoTEMPOL and SSd on JC-1 of HL-7702 cells induced by H2O2

2.1.2 SSd 对 H2O2诱导的 HL-7702 细胞 ATP 的影响 与对照组相比，H2O2作用于HL-7702 细胞，ATP明显降低，差异有统计学意义（P<0.01）；MitoTEM‐POL、SSd 干预后，与H2O2组相比，ATP 明显上升，差异有统计学意义（P<0.01）。H2O2对 HL-7702 的氧化应激损伤使 ATP 生成减少，MitoTEMPOL、SSd 干预后则使ATP生成增多。见图2。

图2 MitoTEMPOL、SSd 对 H2O2 诱导 HL-7702 细胞 ATP变化Fig.2 Effect of MitoTEMPOL and SSd on ATP changes in HL-7702 cells induced by H2O2

2.1.3 SSd 对 H2O2诱导的 HL-7702 细胞 ROS 的影响 与对照组相比，H2O2作用于HL-7702细胞，Mito‐SOX Red荧光强度增强，即ROS升高，差异有统计学意义（P<0.01）；MitoTEMPOL、SSd干预后，与H2O2组相比，MitoSOX Red 荧光强度下降，即ROS 生成降低，差异有统计学意义（P<0.01）。与2.1.1 线粒体功能状态结合来看，H2O2作用于HL-7702细胞，细胞线粒体功能下降，ROS 升高，MitoTEMPOL、SSd 干预后能抑制H2O2诱导的HL-7702 细胞ROS 的升高。见图3。

图3 MitoTEMPOL、SSd 对 H2O2 诱 导 的 HL-7702 细 胞ROS的影响Fig.3 Effect of MitoTEMPOL and SSd on ROS of HL-7702 cells induced by H2O2

2.2 SSd 对 H2O2诱导的 HL-7702 细胞 NLRP3 炎症体表达的影响

2.2.1 SSd 对 H2O2诱导的 HL-7702 细胞 NLRP3 炎症体蛋白表达 与对照组相比，H2O2作用于HL-7702 细胞，NLRP3、ASC、Caspase1 蛋白表达明显上调，差异有统计学意义（P<0.05、P<0.01）；MitoTEM‐POL、SSd 干预后，与H2O2组相比，NLRP3、ASC、Cas‐pase1 蛋白表达明显下调，差异有统计学意义（P<0.01）。见图4。

图4 MitoTEMPOL、SSd 对 HL-7702 细胞 NLRP3 炎症体蛋白表达的影响Fig.4 Effect of MitoTEMPOL and SSd on expression of NLRP3 inflammatory body protein in HL-7702 cells

2.2.2 SSd 对 H2O2诱导的 HL-7702 细胞模型 NL‐RP3 炎症体mRNA 表达的影响 与对照组相比，H2O2作用于HL-7702细胞，NLRP3、ASC、Caspase1基因表达明显上调，差异有统计学意义（P<0.01）；Mito-TEMPOL、SSd 干预后，与H2O2组相比，NLRP3、ASC、Caspase1 基因表达明显下调，差异有统计学意义（P<0.01）。见图5。

图5 MitoTEMPOL、SSd 对 HL-7702 细胞 NLRP3 炎症体基因表达的影响Fig.5 Effect of MitoTEMPOL and SSd on expression of NLRP3 inflammatory body gene in HL-7702 cells

3 讨论

肝脏具有物质合成分解代谢、生物转化和内外分泌等功能，易受到各种致病因素和刺激因子的侵袭，引起肝脏的炎症反应，进而产生损伤［8］。研究表明氧化应激在肝脏疾病中发挥着重要的生物学效应［9］。氧化应激是指细胞活性氧（reactive oxygen species，ROS）的产生超过了细胞自身所能清除的能力而引起的应激损伤［10］。正常情况下，低浓度的ROS 是细胞生长、存活和信号传递所必需的，然而过量的ROS 会导致氧化应激，并导致随后的蛋白质、脂质和DNA 的氧化损伤，促使炎症因子的产生，从而导致肝细胞损伤，也是引起肝硬化、肝纤维化的重要机制［11-12］。

NLRP3 炎症体是机体固有免疫系统的重要组成部分，能够识别各种应激、外源微生物和内源性危险信号，刺激细胞因子释放，使炎症细胞活化，从而在多种炎症疾病的发生发展过程中发挥重要作用［13］。NLRP3 炎症体主要是由 NLRP3、ASC、Cas‐pase1 三者相互作用，形成的一个同心的组织，其中ASC 层包围着 NLRP3 蛋白，而 Caspase1 则附着在外面的 ASC 层上［14］。NLRP3 的炎症体已被报道与急性肝损伤的发病机制有关，在丙型肝炎、非酒精性脂肪性肝炎、酒精性肝炎、肝纤维化、肝脏缺血/再灌注损伤等急慢性肝脏疾病发生发展过程中都存在着NLRP3炎症体的活化［15-20］。NLRP3炎症体活化后，产生有活性的Caspase1，导致IL-1β和IL-18的释放，从而介导炎症反应［21］。

为深入探究SSd抑制细胞氧化应激和NLRP3炎症小体活化减轻ALI 的机理，本研究采用H2O2诱导氧化应激损伤模型，使用线粒体靶向抗氧化剂Mito‐TEMPOL 清除线粒体来源的ROS，寻找ROS 与NL‐RP3 炎症体的关系，并使用SSd 干预探究其作用机制［22-23］。结果提示 H2O2对 HL-7702 的氧化应激损伤使线粒体膜电位有下降趋势，ATP 生成减少，Mito‐SOX Red 荧光强度增强，ROS 生成增多，NLRP3、ASC、Caspase1蛋白及基因表达明显上调；使用Mito‐TEMPOL 干预后，抑制了 H2O2对 HL-7702 细胞线粒体膜电位的下降、ATP 生成的减少、MitoSOX Red 荧光强度的增强、ROS 的生成，同时伴随着NLRP3、ASC、Caspase1 蛋白及基因表达的下调。提示使用MitoTEMPOL清除线粒体来源ROS后，NLRP3、ASC、Caspase1蛋白及基因表达明显下调。说明了NLRP3炎症体表达与线粒体来源ROS 相关性，线粒体来源的ROS 是NLRP3 炎症体活化的上游调节信号。同时，SSd 也能达到同样的作用，提示SSd 可以保护H2O2诱导HL-7702 细胞线粒体的功能损伤，清除线粒体来源的ROS，同时发现SSd 能通过下调线粒体ROS-NLRP3信号通路，发挥抗氧化、抗炎的作用。

ROS 作为细胞内第二信使参与了NLRP3 的活化，ROS 是一个重要的上游信号调节炎症体NLRP3的活化，但ROS 的来源和调控仍不清楚［24-26］。ROS可由细胞质、细胞膜、内质网、过氧化物酶体和线粒体以及NADPH 氧化酶等产生，其中线粒体ROS 来源占细胞内ROS 的大部分，且线粒体来源的ROS 对NLRP3 炎症体的激活在动物模型及细胞模型中所证实，与本研究结果一致［27-31］。

前期研究发现SSd 可以抑制细胞氧化应激和NLRP3 炎症体活化从而减轻ALI，然而作用途径未知。本研究发现H2O2诱导的HL-7702细胞中线粒体来源的ROS是NLRP3炎症体活化的上游调节信号，SSd 可以减少线粒体ROS 的产生，抑制NLRP3 炎症体蛋白及基因的表达，发挥抗氧化、抗炎的作用。本研究为SSd 治疗ALI 的潜在疗效提供了新的证据，为进一步研发应用提供了更多的基础研究支持。