正清风痛宁缓释片通过调控HOTAIRM1/miR-137 轴影响人类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞凋亡的机制研究①

盛雪鹤 解雪峰 （安徽医科大学药学院，合肥230032）

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一类以滑膜炎症和关节破坏为特征的自身免疫性疾病，其病理特点主要表现为滑膜细胞“肿瘤样”增殖和炎症［1-2］。成纤维样滑膜细胞（fibroblast-like synovio‐cytes，FLS）是关节滑膜细胞中的主要效应细胞，在RA 的滑膜炎症和关节破坏中起重要作用，其凋亡不足与RA 滑膜增生密切相关［3］。正清风痛宁缓释片是临床常用的治疗RA 的药物，疗效显著，但其治疗RA 的具体机制尚未明确［4］。长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）和微小 RNA（mi‐croRNA，miRNA）是两类小分子非编码RNA，参与调控细胞生长、凋亡和迁移等生物学行为，是免疫性疾病、肿瘤等疾病治疗的潜在靶点［5-6］。研究还表明，lncRNA 与miRNA 存在相互作用，两者共同参与疾病的发生发展［7］。HOXA 转录本反义RNA1（HO‐TAIRM1）是一种lncRNA，有报道称，其在RA患者外周血淋巴细胞中表达升高，但还未见其影响FLS 凋亡的相关报道［8］。生物信息学软件预测显示，HO‐TAIRM1 与miR-137 的核苷酸序列存在连续结合位点，miR-137 可能是HOTAIRM1 的靶基因。研究显示，miR-137 在 FLS 中呈低表达，过表达 miR-137 可降低FLS 的增殖、迁移和侵袭及炎症细胞因子的表达，可能是骨关节炎的治疗靶点［9］。因此，本研究以HOTAIRM1/miR-137 轴为切入点，观察正清风痛宁缓释片对FLS 凋亡的影响，初步探讨其治疗RA 的机制。

1 材料与方法

1.1 材料 胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）、DMEM 培养基、细胞计数试剂盒（cell counting kit-8，CCK-8）、胰蛋白酶、二喹啉甲酸（bicinchoninicacid，BCA）蛋白检测试剂盒、膜联蛋白V（Annexin V）-异硫氰酸荧光素（FITC）/碘化丙啶（propidium iodide，PI）细胞凋亡试剂盒和双荧光素酶活性检测试剂盒均购自北京索莱宝科技有限公司，Lipofectami‐neTM2000 试剂盒购自美国 Invitrogen 公司，Trizol 试剂、逆转录试剂盒和PCR 试剂盒购自深圳晶美生物工程有限公司，PCR 引物由上海生工生物工程有限公司设计并合成，HOTAIRM1的小干扰RNA（si-HO‐TAIRM1）及乱序无意义阴性序列（si-NC）、HO‐TAIRM1 过表达载体（pcDNA-HOTAIRM1）及阴性对照空载体（pcDNA）、miR-137 抑制剂（anti-miR-137）及抑制剂阴性序列（anti-miR-NC）由广州锐博生物科技有限公司设计并合成，兔抗人半胱天冬酶-3（Caspase-3）单克隆抗体购自美国Santa Cruz 公司，IL-1α和IL-6试剂盒均购自南京建成生物研究所。

1.2 方法

1.2.1 分离与培养FLS 参照文献方法分离和培养FLS［10］。取于本院关节外科行膝关节置换的RA患者滑膜组织，迅速采用磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）清洗3 次，分离滑膜，去除多余脂肪和纤维组织。使用眼科剪将滑膜组织剪至2~3 mm3，加入含10 % 1 mg/ml Ⅱ型胶原酶的高糖型DMEM 培养基，置于37℃培养箱中消化3~4 h，消化后加入含10% FBS 的DMEM 培养基（完全培养基）终止消化，1 500/rmin 离心 10 min，离心半径18 cm。吸弃上清，加入完全培养基，接种至25 cm2培养瓶中，37℃培养箱培养。培养5 d 后，第1 次换液，此后每2~3 d 更换1 次培养基。当细胞融合至80%左右时，加入0.25%胰蛋白酶消化，进行传代培养。

1.2.2 FLS 分组处理 FLS 分为对照组：细胞正常培养；实验组：分别用含 0.05、0.1、0.2 mg/ml 正清风痛宁缓释片的完全培养基培养24 h［11］。对数增殖期的FLS以1×105个/孔接种于6孔板中，当细胞融合至60%时，分别将si-HOTAIRM1、si-NC、pcDNA-HO‐TAIRM1、pcDNA、anti-miR-137、anti-miR-NC 转染至FLS，具体转染操作参照LipofectamineTM2000 试剂盒说明书，转染24 h 后，收集细胞备用。转染si-HO‐TAIRM1、si-NC 的 FLS 培养 24 h，分别记为 si-HO‐TAIRM1 组 和 si-NC 组 。 转 染 pcDNA-HOTAIRM1、pcDNA、anti-miR-137、anti-miR-NC 的 FLS 均 用 含0.2 mg/ml 正清风痛宁缓释片的完全培养基培养24 h，分别记为 0.2 mg/ml+pcDNA-HOTAIRM1 组、0.2 mg/ml+pcDNA 组、0.2 mg/ml+anti-miR-137 组、0.2 mg/ml+anti-miR-NC组。

1.2.3 CCK-8 法检测细胞存活率 各组细胞以5×103个接种于 96 孔板中，每组 3 个复孔。按照1.2.2 分组培养后，每孔加入 10 μl CCK8 溶液，培养箱继续孵育4 h，于酶标仪450 nm 处测定吸光度值（absorbance，A）。实验重复3 次。细胞存活率（%）=A实验组/A对照组×100%。

1.2.4 流式细胞术检测细胞凋亡 各组细胞以2.5×104个/孔接种于24 孔板中，每组3 个复孔。按照1.2.2 分组培养后，胰蛋白酶消化。取1.0×106个细胞，PBS 清洗 2 次，1 500/rmin 离心 5 min，离心半径18 cm。吸弃上清，加入500 μl 结合缓冲液，混悬细胞。加入10 μl Annexin V-FITC，室温避光孵育10 min。加入5 μl PI，室温避光孵育5 min，流式细胞仪检测细胞凋亡。细胞凋亡率（%）=（早期凋亡数+晚期凋亡数）/总细胞数×100%。

1.2.5 Western blot 法 检 测 Caspase-3 蛋白表达 RIPA蛋白裂解液提取细胞中总蛋白，BCA法对蛋白进行定量。取适量蛋白，100℃煮沸5 min。蛋白变性后，行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳后，湿转至聚偏二氟乙烯膜。转膜后，于5%脱脂牛奶中封闭2 h。然后于Caspase-3 抗体孵育中，4℃孵育过夜。洗膜后，于二抗孵育液中，37℃孵育1 h。洗膜后，滴加ELC 显影液，避光显影，凝胶成像系统曝光拍照。以GAPDH 为内参，Image J 软件分析条带灰度值。

1.2.6 ELISA检测细胞中IL-1α和IL-6表达水平 各组细胞以2.5×104个/孔接种于24孔板中，每组3个复孔。按照1.2.2分组培养后，胰蛋白酶消化，收集细胞。加入细胞裂解液充分裂解细胞，3 500/rmin离心5 min，离心半径18 cm。分别参照IL-1α和IL-6试剂盒检测上清中IL-1α、IL-6水平。

1.2.7 实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测细胞中HOTAIRM1 和 miR-137 表达水平 Trizol 试剂提取细胞中总RNA，微量核酸仪检测RNA浓度后进行定量。使用逆转录试剂盒将RNA 合成为cDNA。以cDNA 为模板，进行扩增。扩增程序：95℃ 5 min，95℃ 10 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，共 35 个循环。HO‐TAIRM1上游5'-TGCGCAGGCCGTCAGCTG-3'，下游5'-CGTACGCCCGCAAAGTCGCG-3'；GAPDH上游5'-GCTGACAGCTAGCGCTGACG-3'，下游 5'-GCGCGAAAGCTGATTTGCAACG-3'；miR-137上游5'-GCTCGACACGTGCGTCTCT-3'，下游 5'-CTGACTGTGAAC‐GTGAATC-3'；U6 上游 5'-CGTGTAAGCTGATCTCC‐GAC-3'，下游 5'-CGAATCAAGCTAGGCCACGTG-3'。HOTAIRM1 以 GAPDH 为内参 ，miR-137 以 U6 为 内参，2-ΔΔCt法计算 HOTAIRM1 和 miR-137 的相对表达水平。

1.2.8 HOTAIRM1 和 miR-137 靶向关系验证 PCR 扩增含miR-137结合位点的HOTAIRM1的核苷酸序列，克隆至pYr-MirTarget载体，构建HOTAIRM1野生型荧光素酶报告质粒（HOTAIRM1-WT）。利用基因突变技术将结合位点突变，克隆至pYr-MirTar‐get 载体，构建HOTAIRM1 突变型荧光素酶报告质粒（HOTAIRM1-MUT）。分别将HOTAIRM1-WT、HOTAIRM1-MUT 与 miR-137 mimic 或 miR-NC 共 转 染 至FLS。转染24 h 后，收集细胞。参照双荧光素酶活性检测试剂盒操作说明，检测荧光素酶活性。同时转染 si-HOTAIRM1、si-NC、pcDNA-HOTAIRM1、pc-DNA 后的FLS 以2.5×104个/孔接种于24 孔板中，每组3 个复孔。培养24 h 后，胰蛋白酶消化，收集细胞，RT-qPCR 法检测细胞中miR-137表达水平，方法同1.2.7。

1.3 统计学分析 利用SPSS22.0软件分析实验数据。计量资料以表示。两组间比较采用独立样本t检验。多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用SNK-q检验。以P<0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 正清风痛宁缓释片对FLS 存活率及凋亡的影响 与对照组比较，不同剂量正清风痛宁缓释片组细胞存活率显著降低（P<0.05），凋亡率和Caspase-3蛋白水平显著升高（P<0.05）。见图1和表1。

表1 正清风痛宁缓释片对FLS 存活率及凋亡的影响（，n=9）Tab.1 Effect of Zhengqing Fengtongning sustained re⁃lease tablet on survival rate and apoptosis of FLS（，n=9）

表1 正清风痛宁缓释片对FLS 存活率及凋亡的影响（，n=9）Tab.1 Effect of Zhengqing Fengtongning sustained re⁃lease tablet on survival rate and apoptosis of FLS（，n=9）

Note：Compared with Con group，1）P<0.05.

Apoptosis rate（%）8.84±1.01 13.37±1.341）16.42±1.581）19.16±1.831）81.335<0.001 Groups Con 0.05 mg/ ml 0.1 mg/ ml 0.2 mg/ ml F P Caspase-3 0.28±0.03 0.37±0.031）0.52±0.041）0.63±0.051）147.661<0.001 Survival rate（%）100.03±10.01 89.59±8.671）77.15±7.311）56.61±5.351）48.737<0.001

图1 正清风痛宁缓释片对FLS凋亡及Caspase-3蛋白表达的影响Fig.1 Effect of Zhengqingfengtongning sustained release tablets on apoptosis and Caspase-3 protein expres⁃sion of FLS

2.2 正清风痛宁缓释片对FLS中HOTAIRM1、miR-137 及炎症因子表达的影响 与对照组比较，不同剂量正清风痛宁缓释片组细胞HOTAIRM1、IL-1α和 IL-6 表达水平显著降低（P<0.05），miR-137 表达水平显著升高（P<0.05）。见表2。

表2 正清风痛宁缓释片对FLS 中HOTAIRM1、miR-137及炎症因子表达的影响（，n=9）Tab.2 Effects of Zhengqing Fengtongning sustained re⁃lease tablets on expression of HOTAIRM1，miR-137 and inflammatory factors in FLS（，n=9）

表2 正清风痛宁缓释片对FLS 中HOTAIRM1、miR-137及炎症因子表达的影响（，n=9）Tab.2 Effects of Zhengqing Fengtongning sustained re⁃lease tablets on expression of HOTAIRM1，miR-137 and inflammatory factors in FLS（，n=9）

Note：Compared with Con group，1）P<0.05.

IL-6（pg/ ml）98.28±7.15 74.66±6.691）59.93±5.641）50.10±5.111）102.732<0.001 Groups Con 0.05 mg/ ml 0.1 mg/ ml 0.2 mg/ ml F P HOTAIRM1 1.01±0.07 0.82±0.061）0.68±0.061）0.47±0.051）127.973<0.001 miR-137 0.99±0.09 1.21±0.101）1.37±0.111）1.55±0.121）45.740<0.001 IL-1α（pg/ ml）85.14±6.23 68.03±6.021）45.21±5.071）39.26±4.161）136.604<0.001

2.3 抑制HOTAIRM1 对FLS 存活率、凋亡及炎症因子表达的影响 与si-NC 组比较，si-HOTAIRM1组细胞中 HOTAIRM1、IL-1α 和 IL-6 表达水平、细胞存活率显著降低（P<0.05），细胞凋亡率和Caspase-3蛋白表达水平显著升高（P<0.05）。见图2 和表3。

表3 抑制HOTAIRM1对FLS存活率、凋亡及炎症因子表达的影响（，n=9）Tab.3 Effect of inhibiting HOTAIRM1 on FLS survival，apoptosis and expression of inflammatory factors（，n=9）

表3 抑制HOTAIRM1对FLS存活率、凋亡及炎症因子表达的影响（，n=9）Tab.3 Effect of inhibiting HOTAIRM1 on FLS survival，apoptosis and expression of inflammatory factors（，n=9）

Note：Compared with si-NC group，1）P<0.05.

Apoptosis rate（%）8.69±0.98 17.15±1.311）15.513<0.001 Groups si-NC si-HOTAIRM1 t P HOTAIRM1 1.00±0.06 0.34±0.041）27.458<0.001 Caspase-3 0.27±0.03 0.51±0.041）14.400<0.001 IL-1α（pg/ ml）85.11±6.18 42.34±4.571）16.694<0.001 IL-6（pg/ ml）97.23±7.04 55.57±5.631）13.865<0.001 Survival rate（%）100.00±10.00 64.21±6.691）8.924<0.001

图2 抑制HOTAIRM1 对FLS 凋亡及Caspase-3 蛋白表达的影响Fig.2 Effect of inhibiting HOTAIRM1 on FLS apoptosis and Caspase-3 protein expression

2.4 HOTAIRM1 靶向调控miR-137 生物信息学软件预测显示，HOTAIRM1 与miR-137 的核苷酸序列存在结合位点，见图3。与共转染WT-HOTAIRM1的miR-NC 组比较，miR-137 组荧光素酶活性显著降低（P<0.05），而与共转染 MUT-HOTAIRM1 的miRNC 组比较，miR-137 组荧光素酶活性无显著变化（P>0.05），见表 4。pcDNA3.1-HOTAIRM1 组细胞中 miR-137 表达水平（0.33±0.04）显著低于 pc-DNA3.1 组（1.01±0.06）（P<0.05），si-HOTAIRM1 组细胞中miR-137 表达水平（1.69±0.09）显著高于si-NC组（0.98±0.06，P<0.05）。

表4 双荧光素酶报告实验结果（，n=9）Tab.4 Double fluorescein report experiment results（，n=9）

表4 双荧光素酶报告实验结果（，n=9）Tab.4 Double fluorescein report experiment results（，n=9）

Note：Compared with miR-NC group，1）P<0.05.

MUT-HOTAIRM1 0.97±0.09 0.95±0.09 0.471 0.644 Groups miR-NC miR-137 t P WT-HOTAIRM1 0.95±0.09 0.24±0.021）23.103<0.001

图3 HOTAIRM1与miR-137的结合位点Fig.3 Binding site of HOTAIRM1 and miR-137

2.5 过表达HOTAIRM1 减弱正清风痛宁缓释片对FLS 存活、凋亡及炎症因子表达的影响 与实验3+pcDNA3.1 组比较，实验3+pcDNA3.1-HOTAIRM1组细胞中 HOTAIRM1、IL-1α 和 IL-6 表达水平、细胞存活率显著升高（P<0.05），细胞凋亡率和Caspase-3蛋白表达水平显著降低（P<0.05）。见图4和表5。

表5 过表达HOTAIRM1能减弱正清风痛宁缓释片对FLS存活率及凋亡及炎症因子表达的影响（，n=9）Tab.5 Over-expressing HOTAIRM1 attenuates effect of Zhengqing Fengtongning sustained release tablets on survival rate，apoptosis and inflammatory factor expression of FLS（，n=9）

表5 过表达HOTAIRM1能减弱正清风痛宁缓释片对FLS存活率及凋亡及炎症因子表达的影响（，n=9）Tab.5 Over-expressing HOTAIRM1 attenuates effect of Zhengqing Fengtongning sustained release tablets on survival rate，apoptosis and inflammatory factor expression of FLS（，n=9）

Note：Compared with experimental 3+pcDNA3.1 group，1）P<0.05.

Apoptosis rate（%）19.10±1.41 11.03±1.111）13.491<0.001 Groups Experimental 3+pcDNA3.1 Experimental 3+pcDNA3.1-HOTAIRM1 t P HOTAIRM1 0.99±0.10 1.88±0.151）14.811<0.001 Caspase-3 0.62±0.04 0.35±0.031）16.200<0.001 IL-1α（pg/ ml）39.34±4.11 72.29±6.631）12.672<0.001 IL-6（pg/ ml）50.14±5.16 81.46±7.031）10.775<0.001 Survival rate（%）56.64±5.61 92.15±8.131）10.785<0.001

图4 过表达HOTAIRM1减弱正清风痛宁缓释片对FLS 凋亡及Caspase-3蛋白表达的影响Fig.4 Over-expressing HOTAIRM1 attenuates effect of Zhengqing Fengtongning sustained release tablets on FLS apoptosis and expression of Caspase-3 protein

2.6 抑制miR-137 能减弱正清风痛宁缓释片对FLS 存活率及凋亡及炎症因子表达的影响 与实验3+anti-miR-NC 组比较，实验 3+anti-miR-137 组细胞存活率、IL-1α 和IL-6 表达水平显著升高（P<0.05），miR-137、细胞凋亡率和Caspase-3 蛋白表达水平显著降低（P<0.05）。见图5和表6。

图5 抑制miR-137 能减弱正清风痛宁缓释片对FLS 凋亡及Caspase-3蛋白表达的影响Fig.5 Inhibiting miR-137 reduced effect of Zhengqing Fengtongning sustained release tablet on FLS apop⁃tosis and expression of Caspase-3 protein

表6 抑制miR-137能减弱正清风痛宁缓释片对FLS存活率及凋亡及炎症因子表达的影响（，n=9）Tab.6 Inhibiting miR-137 reduced effect of Zhengqing Fengtongning sustained release tablets on FLS survival rate，apop⁃tosis and inflammatory factor expression（，n=9）

表6 抑制miR-137能减弱正清风痛宁缓释片对FLS存活率及凋亡及炎症因子表达的影响（，n=9）Tab.6 Inhibiting miR-137 reduced effect of Zhengqing Fengtongning sustained release tablets on FLS survival rate，apop⁃tosis and inflammatory factor expression（，n=9）

Note：Compared with experimental 3+anti-miR-NC group，1）P<0.05.

Apoptosis rate（%）19.16±1.44 9.93±1.101）15.281<0.001 Experimental 3+anti-miR-NC Experimental 3+anti-miR-137 t P 1.01±0.07 0.41±0.051）20.925<0.001 0.60±0.04 0.33±0.031）16.200<0.001 39.38±4.14 77.73±5.581）18.691<0.001 50.26±5.17 86.14±6.621）12.815<0.001 56.37±5.63 94.06±7.081）12.500<0.001 GroupsmiR-137Caspase-3IL-1α（pg/ ml）IL-6（pg/ ml）Survival rate（%）

3 讨论

正清风痛宁缓释片是以传统治疗风湿性疾病的中药青风藤的主要活性成分青藤碱为主要原料，经现代工艺精制而成的纯中药制剂，是治疗RA 的常用药物。但目前，正清风痛宁缓释片治疗RA 的作用机制还未明确。RA 的发生发展与滑膜增殖密切相关，FLS 的过度增殖与凋亡不足以及炎症被认为是引起滑膜增生的关键因素［12］。本研究显示，正清风痛宁缓释片可能通过促进Caspase-3 蛋白表达诱导FLS凋亡，降低FLS细胞中IL-1α 和IL-6表达减轻炎症反应达到治疗RA 的效果，但其具体的分子机制还有待探讨。

HOTAIRM1 是近年来新发现的一种lncRNA。研究显示，HOTAIRM1 高表达的神经胶质瘤患者预后较差，抑制HOTAIRM1 表达可降低神经胶质瘤的恶性行为，并增加肿瘤对治疗药物替莫唑胺的敏感性［13］。HOTAIRM1 在胰腺导管腺癌组织和细胞中表达升高，抑制HOTAIRM1 通过诱导G0/G1期细胞周期停滞，促进细胞凋亡抑制胰腺导管腺癌细胞增殖和迁移增殖，可能是胰腺导管腺癌新诊断和治疗靶标［14］。但目前，HOTAIRM1对FLS的影响还未知。本研究显示，抑制HOTAIRM1 表达可降低FLS 存活率及IL-1α、IL-6 表达降低，诱导细胞凋亡率及Cas‐pase-3 蛋白表达，提示HOTAIRM1 可能通过促进Caspase-3 蛋白表达诱导FLS 凋亡及降低炎症反应参与RA 发展进程，是RA 的治疗靶点。本研究还显示，正清风痛宁缓释片可降低FLS 中HOTAIRM1 表达，而过表达HOTAIRM1 降低了正清风痛宁缓释片对FLS 凋亡的促进作用及炎症因子IL-1α 和IL-6 表达的抑制作用，提示正清风痛宁缓释片通过抑制HOTAIRM1表达发挥治疗RA的作用。

越来越多的研究表明，lncRNA 可与miRNA 的位点结合，进而调控miRNA 表达影响疾病的发生发展。如lncRNA ZFPM2-AS1在神经母细胞瘤（RB）组织和细胞系中表达明显升高，其充当miR-515 的竞争内源RNA，促进HOXA1 表达，并激活Wnt/βcatenin 信号通路，促进 RB 发展［15］。为了进一步探讨正清风痛宁缓释片抑制HOTAIRM1表达影响FLS凋亡及炎症因子表达的分子机制，通过生物信息学软件预测显示，HOTAIRM1 与miR-137 的核苷酸序列存在结合位点，HOTAIRM 可能调控miR-137 表达来影响RA 发生发展。本研究双荧光素酶活性检测显示，miR-137 mimics 可降低 HOTAIRM1 野生型的荧光素酶活性，而对其突变型的荧光素酶活性无显著影响，说明HOTAIRM1 可与miR-137 的核苷酸序列结合。且上调或下调FLS 中HOTAIRM1 表达后，miR-137 表达下调或上调，证实了HOTAIRM1 在FLS 中靶向负调控miR-137 表达。本研究还显示，正清风痛宁缓释片可促进FLS 表达miR-137，而抑制miR-137 表达可降低正清风痛宁缓释片对FLS 凋亡的促进作用及炎性因子IL-1α 和IL-6 表达的抑制作用，这提示正清风痛宁缓释片通过抑制HO‐TAIRM1 表达，进而上调 miR-137 表达诱导 FLS 凋亡及降低炎症反应，发挥治疗RA的作用。

综上所述，正清风痛宁缓释片可能通过调控HOTAIRM1/miR-137轴诱导FLS凋亡及降低炎症反应，从而发挥治疗RA 的作用。但本研究仅在细胞层面探讨了正清风痛宁缓释片对FLS凋亡和炎症的影响及作用机制，接下来将通过建立动物模型进一步验证和探讨正清风痛宁缓释片治疗RA 的作用机制。