迷迭香酸抑制结肠癌细胞生长和间质转换并抑制AKT 和ERK1/2 的磷酸化

李丽娜 李索妮 王玉珍 郭俊俊 （陕西省肿瘤医院内一科，西安710061）

结肠癌是一种常见的消化道恶性肿瘤，与高脂肪和低纤维素饮食有关，早期无明显症状，随病情发展可表现为腹胀、消化不良、腹痛、黏液便或黏血便等［1］。目前，结肠癌患者主要采用手术结合放化疗的综合治疗手段，以期提高手术切除率，降低术后复发率［2］。但已有多项研究显示，化疗药物的毒副作用较为明显，对正常细胞也具有一定的杀伤作用，可引起恶心、呕吐、血细胞减少等不良反应，甚至导致患者因无法耐受化疗而被迫终止治疗［3-4］。寻求安全有效的治疗药物辅助结肠癌的临床治疗受到了研究者们的广泛关注。迷迭香酸（rosmarinic acid，RA）是迷迭香、夏枯草、丹参、紫苏等多种中药材的有效成分，具有抗炎、抗氧化、抗病毒、抗肿瘤等多种生物学效应［5］。AKT 和 ERK1/2 是细胞内多条重要信号通路的重要组成部分，参与调节结肠癌、乳腺癌、肝癌等多种肿瘤的发生发展［6-7］。既往研究显示［8］，RA 可以调控增殖凋亡相关蛋白的表达，诱导结肠癌细胞凋亡，但其对结肠癌细胞间质转化的影响及机制尚不清楚。因此，本研究探索了RA 对结肠癌细胞生长和间质转化的调节作用，及其对丝/苏氨酸激酶（silk/threonine kinase，AKT）和细胞外信号调节激酶1/2（extracellular signal-regulated kinase，ERK1/2）磷酸化的影响，旨在为 RA 的临床抗肿瘤应用提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料 结肠癌SW480 细胞购于中科院生物研究所；迷迭香酸购自美国Sigma 公司，纯度≥98%；倒置显微镜（CKX41-A32PH）、荧光显微镜（BX-2）均购自日本 Olympus 公司；荧光定量PCR 仪（7500 型）购自美国应用生物系统公司；RPMI1640 培养基、胎牛血清均购自上海经科化学科技有限公司；β-actin 单克隆抗体购自北京索莱宝科技有限公司；兔抗人波形蛋白（Vimentin）、异硫氰酸荧光素（fluorescein iso‐thiocyanate，FITC）标记的二抗均购自美国 Sigma 公司，兔抗人上皮细胞钙黏素（E-cadherin）和神经钙黏素（N-cadherin）、AKT、p-AKT、ERK1/2、p-ERK1/2单克隆抗体均购自美国Santa Cruz 公司；辣根过氧化酶（horseradish peroxidase，HRP）标记羊抗兔免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）均购自丹麦DAKO公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及药物处理 将结肠癌SW480 细胞接种于含10%胎牛血清和0.5%青-链霉素的RP‐MI1640 培养液中，置于37℃、5%CO2培养箱中培养过夜，隔天换液，当细胞融合度至80%以上，开始传代培养。取对数期细胞制成单细胞悬液继续培养过夜，加入100 μl不同浓度的RA（终浓度为0、1、2.5、5、10、20、40、80、160、320 μmol/L）孵育24 h，弃培养液，每孔分别加入10 μl CCK-8 溶液，继续培养4 h，检测490 nm波长的吸光度值，计算各组细胞存活率，根据RA 抑制曲线，设置对照组（RA，0 μmo/lL）、低剂量组（RA，10 μmo/lL）、中剂量组（RA，20 μmo/lL）和高剂量组（RA，40 μmo/lL）。

1.2.2 克隆形成实验检测细胞的生长 取各组对数生长期细胞与相应浓度药物孵育24 h 后，更换为正常培养基于37℃、5%CO2培养箱中继续培养至大多数单个克隆中细胞数>50，PBS 轻轻洗涤2 次，然后每孔加入4%的多聚甲醛室温固定10 min后，PBS轻轻洗涤2 次，每孔加入1%的结晶紫染色，PBS 轻轻洗涤3次，倾斜倒置晾干，观察每孔内细胞克隆数目，计算克隆形成率。

1.2.3 RT-PCT 实验检测细胞增殖相关蛋白Ki67和PCNA mRNA 水平 取各组对数生长期细胞与相应浓度药物孵育24 h 后，采用Trizol 法提取各组细胞的总RNA，经紫外分光光度仪确定RNA 浓度，取2 μg 总 RNA 进行反转录合成 cDNA，以GAPDH（上游引物：5'-GGTCGGAGTCAACGGATTTGGTCG-3'，下游引物：5'-CCTCCGACGCCTGCTTCACCAC-3'）作为内参，进行RT-PCR 反应检测Ki67（上游引物：5'-GCAGGACTTCACTTGCTTCC-3'，下游引物：5'-TCATTTGCGTTTGTTTCACG-3'）和PCNA（上游引物：5'-TTTGAGGCACGCCTGATCC-3'，下游引物：5'-GGAGACGTGAGACGAGTCCAT-3'），采用 2-ΔΔCt法计算相对表达量。

1.2.4 显微镜下观察细胞上皮间质转化（EMT） 取各组对数生长期细胞与相应浓度药物孵育24 h后，更换为正常培养基于37℃、5%CO2培养箱中继续培养5 d后，在显微镜下观察各组细胞形态的变化。

1.2.5 免疫荧光检测EMT 标志蛋白Vimentin 的表达 取各组对数生长期细胞与相应浓度药物孵育24 h 后，采用4%多聚甲醛在室温下固定20 min，加入0.1%Trixon X 渗透10 min，再加5%牛血清白蛋白封闭1 h，加入一抗（Vimentin，稀释比例为1∶1 000）4℃孵育过夜。PBS 冲洗，加FITC 标记的二抗（稀释比例为1∶1 000）室温避光孵育1 h，二脒基苯基吲哚（diamidine phenyl indoles，DAPI）反应10 min，PBS 冲洗，封片。在荧光显微镜下观察并拍照，采用Image Pro Plus 6.0分析荧光强度。

1.2.6 Western blot 检 测 E-cadherin、N-cadherin、AKT 和ERK1/2 的表达 取各组对数生长期细胞与相应浓度药物孵育24 h 后，提取细胞总蛋白，经BCA 法测定蛋白浓度，依次采用SDS-PAGE 凝胶电泳，电转膜至聚偏二氟乙烯膜，室温下封闭2 h，TBST 洗膜并加一抗（E-cadherin 和 N-cadherin，稀释比例均为1∶1 000）在4℃孵育过夜，采用洗膜缓冲液洗膜加二抗（稀释比例为1∶5 000）室温下孵育2 h，以β-actin为内参，电化学发光显像，凝胶成像系统分析对比条带强弱。

1.3 统计学分析 采用SPSS22.0软件对所得数据进行分析，满足正态分布的计量资料均以表示，单因素方差分析比较三组间差异，SNK-q比较三组两两间差异，以P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RA抑制SW480细胞的剂量筛选 CCK-8结果（图1）显示，RA 对SW480细胞的抑制作用呈药物浓度依赖性，且当RA 浓度≥20 μmo/lL，细胞的存活率明显降低（P<0.05）。因此设置RA 低剂量、中剂量、高剂量组的浓度分别为10、20、40 μmo/lL。

图1 RA抑制SW480细胞的剂量筛选Fig.1 Dose screening of SW480 cells inhibited by RA

2.2 RA 抑制SW480 细胞增殖 克隆形成试验结果（图 2A、B）显示：随着 RA 剂量增加，RA 浓度为20 μmo/lL 和 40 μmo/lL 时，细胞的克隆形成率明显下降（P<0.05）。RT-PCR结果（图2C）显示，随着RA剂量增加，RA 浓度为20 μmo/lL和40 μmo/lL时，细胞Ki67和PCNA mRNA水平明显下降（P<0.05）。

图2 RA抑制SW480细胞增殖Fig.2 Proliferation of SW480 cell inhibited by RA

2.3 RA 抑制SW480 细胞EMT 显微镜下观察细胞形态变化，结果显示（图3），随着RA 剂量的增加，SW480 细胞核皱缩变小，体积变小，上皮细胞分散，表现出间质细胞形态。

图3 RA抑制SW480细胞上皮间质转化Fig.3 Epithelial-mesenchymal transition of SW480 cell in⁃hibited by RA

2.4 RA 调节SW480 细胞EMT 标志蛋白的表达 Western blot 结果（图4A、4B）显示，随着RA 剂量增加，RA浓度为20 μmo/lL和40 μmo/lL时，细胞E-cadherin 蛋白表达明显增加（P<0.05），N-cadherin 蛋白表达明显下降（P<0.05）。免疫荧光结果（图4C、4D）显示，随着RA剂量增加，RA浓度为20 μmo/lL和40 μmo/lL 时，细胞Vimentin 蛋白表达明显下降（P<0.05）。

图4 RA调节SW480细胞EMT标志蛋白的表达Fig.4 Epithelial-mesenchymal transition associated pro⁃teins of SW480 cell inhibited by RA

2.5 RA 抑制 SW480 细胞 AKT 和 ERK1/2 的磷 酸化 Western blot 结果（图5）显示，随着RA 剂量增加，RA 浓度为20 μmol/L和40 μmol/L时，细胞AKT和ERK1/2的磷酸化水平明显降低（P<0.05）。

图5 RA抑制SW480细胞AKT和ERK1/2的磷酸化Fig.5 Phosphorylation of AKT and ERK1/2 of SW480 cell inhibited by RA

3 讨论

结肠癌患者临床主要采用手术治疗，但由于其位置深入盆腔，解剖结构较为复杂，单纯手术治疗后难以彻底清除病灶组织，术后复发率较高［9］。化疗是目前治疗癌症的主要手段之一，可以用于术前或术后辅助治疗，降低术后复发率［10］。然而，化疗药物为细胞毒药物，长期治疗可出现不同程度的毒副作用，影响治疗效果［11］。RA 是近年来从迷迭香中分离得到的一种天然酚酸类化合物，具有广泛的生物学作用，可以调节机体多条重要信号通路的表达，发挥抗肿瘤作用［12］。因此，本研究分析了RA 对结肠癌细胞生物学行为的影响及可能的作用机制。本研究发现，RA 对SW480 细胞的抑制作用呈药物浓度依赖性，当RA 浓度达到20 μmol/L 及以上可以明显抑制细胞增殖，促进细胞中Ki67 和PCNA mRNA 水平。Ki67 和PCNA 均为细胞增殖相关蛋白，与DNA 合成密切相关，其水平随着细胞有丝分裂进程而变化，可以敏感的反映多种肿瘤细胞的增殖活性［13］。郑艳侠等［14］的研究发现，RA 可以抑制肝癌细胞的增殖，诱导肝癌细胞凋亡，提示RA 可以浓度依赖性的方式调节SW480 细胞增殖相关蛋白的表达，抑制细胞的增殖活性，发挥抗肿瘤作用。

EMT 是肿瘤细胞脱离原发病灶向周围或远处组织扩散的基础，在肿瘤的侵袭、迁移过程中发挥重要的作用［15］。E-cadherin 是一种钙依赖性的上皮性标记蛋白，主要分布于上皮组织，可以介导细胞间的黏附作用，其表达降低或缺失，可促进癌细胞发生脱落、转移，促进肿瘤细胞的侵袭和迁移［16］。N-cadherin 一种钙依赖的细胞表面黏附分子，可以介导癌细胞的黏附和迁移，促进肿瘤细胞的恶性生物学行为［17］。本研究中，当RA 浓度达到20 μmol/L及以上可以抑制细胞的EMT，促进细胞中E-cad‐herin 的表达，抑制 N-cadherin 和 Vimentin 的表达，且随着浓度升高其抑制作用增强，提示RA 可以浓度依赖性的方式调节E-cadherin/N-cadherin 蛋白的表达，抑制 SW480 细胞 EMT 的发生。Vimentin 属于中间丝蛋白家族，主要表达于间充质细胞，是细胞骨架的组成成分，其表达阳性是肿瘤细胞发生EMT 的标志，可以调节细胞的黏附功能，促进肿瘤细胞的侵袭和迁移［18］，提示RA 可以浓度依赖性的方式调节 Vimentin 蛋白的表达，抑制 SW480 细胞 EMT 的发生，抑制细胞的侵袭和迁移。HAN 等［19］的研究表明，RA 可以调节结肠癌CT26 细胞E-cadherin/N-cadherin 和 Vimentin 蛋白的表达，抑制细胞 EMT 的发生，本研究结果与其部分一致，提示RA 可以浓度依赖性的方式调节SW480 细胞EMT 相关蛋白的表达，抑制EMT的发生，抑制肿瘤的侵袭和迁移。

本研究中，当 RA 浓度达到 20 μmol/L 及以上可以抑制AKT 的磷酸化水平。AKT 是丝/苏氨酸蛋白激酶，包括 AKT1、AKT2 和 AKT3 三种异构体，是PI3K 重要的下游分子，其磷酸化可以激活下游mTOR、p70S6K、GSK-3 等多种蛋白的表达，调节细胞的生长、增殖、迁移等多种生物学行为［20-21］。杨沛霖等［22］的研究显示，RA 可以调节PI3K/AKT/mTOR信号通路的表达，抑制鼻咽癌细胞增殖，提示RA 可能通过抑制AKT 的磷酸化，参与调节机体多条信号通路的表达，抑制SW480 细胞的恶性生物学行为。本研究中，当RA 浓度达到20 μmol/L 及以上可以抑制ERK1/2的磷酸化水平，提示RA对SW480的抑制作用可能与ERK1/2 的磷酸化有关。ERK1/2 包括ERK1 和ERK2，是一种细胞外调节蛋白激酶，可以将细胞外信号从表面受体传导至细胞核，在肿瘤细胞的增殖、侵袭、迁移中发挥重要的调节作用［23］。研究显示，ERK 活化后可由胞质转位到核内，介导下游激活子蛋白-1（activator protein 1，AP-1）、c-fos、c-Jun等的转录活化，参与调节肿瘤细胞的生物学行为，提示RA 可能通过抑制ERK 的磷酸化，调节癌基因的表达，抑制SW480细胞的生物学行为［24］。

综上所述，当 RA 浓度达到 20 μmol/L 及以上可以明显抑制SW480 细胞增殖和间质转换，其作用机制可能与抑制AKT 和ERK 的磷酸化有关。本研究不足之处在于仅初步探索了RA 对SW480 细胞生长和间质转化的影响及可能的机制，但作用的关键靶蛋白尚不清楚，有待于进一步研究。