LINC00680 靶向miR-431-5p 调控胃癌细胞增殖、上皮间充质转化、迁移和侵袭

陈和萍 韩钧凌 俞力军 邢 苑 张 宏

（中国人民解放军联勤保障部队第九二八医院消化内科，海口570206）

胃癌是最常见的人类胃肠恶性肿瘤之一，是导致全球癌症相关死亡的第二大原因［1］。大多数胃癌患者被诊断为晚期，并伴有恶性增殖、广泛浸润和淋巴转移，手术、放化疗和靶向治疗联合应用后效果有限，死亡率较高［2-3］。近年来，长链非编码RNA（lncRNA）调控微小RNA（miRNA）在肿瘤发生、转移、耐药进程中的复杂作用引起研究者的广泛关注。LINC00680最初被鉴定为一种保护性生物标志物，是软组织肉瘤的独立预后指标［4］。在胶质瘤中LINC00680 高表达却促进癌细胞的增殖、迁移和转移，抑制细胞凋亡，发挥致癌作用［5］。序列分析发现，miR-431-5p 与LINC00680 之间存在相互作用。既往研究显示，胰腺癌、结肠癌中miR-431-5p 表达降低，过表达miR-431-5p 对肿瘤进展具有抑制作用［6-7］。然而LINC00680 在胃癌进展中的作用，其机制是否与调控miR-431-5p 有关仍不清楚。本研究通过检测胃癌细胞中LINC00680、miR-431-5p 表达水平，探讨抑制LINC00680 或过表达miR-431-5p 对胃癌细胞增殖、上皮间充质转化（epithelial mesen‐chymal transition，EMT）、迁移和侵袭的影响，分析LINC00680 和miR-431-5p 之间调控关系，以期为胃癌治疗提供有效靶点。

1 材料与方法

1.1 材料 人胃黏膜上皮永生细胞系GES1、胃癌细胞系SNU-1、HS-746T 和AGS 购于中国科学院上海细胞库；RPMI1640 培养基、青链霉素双抗、胎牛血清购于武汉普诺赛生命科技公司；所有载体、序列片段由北京华大基因公司提供；逆转录试剂盒、双荧光素酶报告基因检测系统购于Promega 公司；SYBR Premix Ex Taq Ⅱ购于大连 TaKaRa 公司；细胞计数试剂盒（CCK-8）购于上海晶抗生物；Transwell小室和基质胶购于美国康宁公司；细胞周期素D1（CyclinD1）、基质金属蛋白酶2（MMP2）、MMP9 兔多克隆抗体、羊抗鼠IgG 二抗购于美国Abcam 公司；上皮细胞钙黏蛋白（E-Cadherin）、神经钙黏素（N-Cad‐herin）、波形蛋白（Vimentin）鼠单克隆抗体、羊抗鼠IgG二抗购于美国Santa Cruz公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养、转染和分组 GES1、SNU-1、HS-746T 和AGS 均细胞采用添加10%胎牛血清、1%青链霉素双抗的RPMI1640 培养基置于37℃、CO2体积分数为5%的培养箱中培养。当细胞80%融合时，加入胰酶消化细胞，用新鲜完全培养基按照1∶3 比例将细胞转移至新的培养瓶传代培养。将AGS 细胞接种6孔板，当细胞50%融合时，利用脂质体转染试剂Lipofectamine2000将si-NC、si-LINC00680、miRNC、miR-431-5p mimics、si-LINC00680+anti-miR-NC、si-LINC00680+anti-miR-431-5p 分别转染至 AGS 细胞，依次记为 si-NC 组、si-LINC00680 组、miR-NC 组、miR-431-5p 组、si-LINC00680+anti-miR-NC 组、si-LINC00680+anti-miR-431-5p 组，48 h 后收集细胞检测转染效果，合格后进行后续实验。

1.2.2 RT-qPCR 检 测 LINC00680 和 miR-431-5p 表达 TRIzol 试剂提取 GES1、SNU-1、HS-746T 以及各组AGS 细胞总RNA。使用逆转录试剂盒进行逆转录以生成cDNA，利用SYBR Premix Ex Taq Ⅱ在荧光定量 PCR 仪上进行 RT-qPCR 反应，2-ΔΔCt公式计算LINC00680（内参为 β-actin）和miR-431-5p（内参为U6）相对表达量。LINC00680 上游引物5'-CCATC‐GACTGGCTCATCACAA-3'，下游引物5'-GGGGCAAGGCAAATCAATACC-3'；β-actin 上游引物 5'-TCACCCACACTGTGCCCATCTACGA-3'，下 游 引 物 5'-CAGCGGAACCGCTCATTGCCAATGG-3'；miR-431-5p上游引物5′-TGTCTTGCAGGCCGTCATG-3′，下游引物 5′-GCTGTCAACGATACGCTACCTA-3′；U6 上游引物 5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。

1.2.3 CCK-8法检测细胞活力 每组取1×104个细胞接种 96 孔板，贴壁后每孔添加 10 μl 的 CCK-8 溶液。孵育2 h 后，空白孔归零，采用酶标仪检测实验孔在450 nm的光密度（OD）值。

1.2.4 Transwell 实验检测细胞迁移和侵袭 用稀释的基质胶包被Transwell 上腔室膜进行侵袭实验。每组取1×104个AGS细胞接种Transwell上腔室中，加入200 μl无血清培养基。24孔板下室中加入500 μl含10%胎牛血清的细胞培养基作为诱导剂。培养箱孵育24 h，棉签除去基质胶和未过膜细胞。甲醇固定侵袭过膜的细胞，结晶紫染色15 min。显微镜观察细胞，随机选取5 个视野计数采用均数表示细胞侵袭数量。迁移实验时采用未包被基质胶的小室，其他步骤与侵袭实验一致。

1.2.5 Western blot 检测 CyclinD1、MMP2、MMP9、E-Cadherin、N-Cadherin 和 Vimentin 蛋白表达 裂解各组细胞提取总蛋白。定量后，采用10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳分离等量的蛋白，并利用湿法转膜仪转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜。用含5%脱脂牛奶缓冲液封闭膜后，将膜与一抗溶液（CyclinD1 和 MMP9 为 1∶1 000 稀释，MMP2、E-Cadherin、N-Cadherin、Vimentin 为1∶500 稀释）4℃下孵育12 h。随后用稀释的二抗孵育2 h。用增强的化学发光试剂盒检测蛋白印迹，Image J 软件分析目的蛋白相对表达量（内参β-actin）。

1.2.6 双荧光素酶报告基因实验 构建含有miR-431-5p 结合位点的 LINC00680 野生型（WT）或突变型（MUT）片段，将其插入荧光素酶报告质粒pGL3获 得 WT-LINC00680、MUT-LINC00680。 将 WTLINC00680、MUT-LINC00680 分 别 与 miR-431-5p mimics、miR-NC 分别共转染至 AGS 细胞，48 h 后双荧光素酶报告基因检测系统测定共转染细胞中的荧光素酶活性。将pcDNA-NC、pcDNA-LINC00680、si-NC、si-LINC00680 分别转染至 AGS 细胞，48 h 后参照RT-qPCR步骤检测miR-431-5p表达水平。

1.3 统计学分析 每组设置3 个平行实验，重复3 遍，计量资料以表示。采用 SPSS20.0 软件进行统计学分析，t检验用于两组间差异比较；单因素方差用于多组间差异比较，进一步两两比较采用LSD-t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 胃癌细胞系中LINC00680 和miR-431-5p 表达情况 结果如图1 所示，胃癌细胞系SNU-1、AGS、HS-746T 中LINC00680 表达量较人胃黏膜上皮永生细胞系GES1 显著升高，miR-431-5p 表达量较GES1细胞系显著降低（P<0.05）。

图1 胃癌细胞系中miR-431-5p和LINC00680表达量Fig.1 Expression of miR-431-5p and LINC00680 in gas⁃tric cancer cell lines

2.2 抑制LINC00680 表达对AGS 胃癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响 结果如表1 和图2 所示，si-LINC00680 组 AGS 细 胞 LINC00680 表 达 量 较 si-NC组显著降低（P<0.05），提示转染 si-LINC00680 后AGS 细胞LINC00680 表达受到抑制。抑制LINC-00680 表达后，AGS 细胞活力、迁移和侵袭数量、Cy‐clinD1、MMP2 和MMP9 蛋白表达量均显著降低（P<0.05）。

表1 抑制LINC00680表达对AGS胃癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响（，n=9）Tab.1 Effect of inhibiting LINC00680 on proliferation，migration and invasion of AGS gastric cancer cells（，n=9）

表1 抑制LINC00680表达对AGS胃癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响（，n=9）Tab.1 Effect of inhibiting LINC00680 on proliferation，migration and invasion of AGS gastric cancer cells（，n=9）

Note：Compared with si-NC，1）P<0.05.

Cell invasion number（n）141.12±12.37 71.06±6.391）15.423 0.000 Groups LINC00680CyclinD1MMP2MMP9OD490 nm si-NC si-LINC00680 t P 1.00±0.10 0.36±0.041）17.827 0.000 0.98±0.10 0.48±0.051）13.416 0.000 0.84±0.08 0.35±0.031）17.205 0.000 0.78±0.07 0.33±0.031）17.726 0.000 1.02±0.10 0.48±0.041）14.958 0.000 Cell migration number（n）183.16±15.13 89.05±8.241）16.388 0.000

图2 抑制LINC00680 表达对AGS 胃癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响Fig.2 Effect of inhibiting LINC00680 on proliferation，migration and invasion of AGS gastric cancer cells

2.3 过表达miR-431-5p 对AGS 胃癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响 结果如图3和表2所示，miR-431-5p组AGS细胞中miR-431-5p表达量较miR-NC 组显著升高（P<0.05），提示转染 miR-431-5p mimics 后AGS 细胞miR-431-5p 表达得到上调。过表达miR-431-5p 后，AGS 细胞活力、迁移和侵袭数量、Cy‐clinD1、MMP2 和MMP9 蛋白表达量均显著降低（P<0.05）。

表2 过表达miR-431-5p对AGS胃癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响（，n=9）Tab.2 Effect of miR-431-5p overexpression on proliferation，migration and invasion of AGS gastric cancer cells（，n=9）

表2 过表达miR-431-5p对AGS胃癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响（，n=9）Tab.2 Effect of miR-431-5p overexpression on proliferation，migration and invasion of AGS gastric cancer cells（，n=9）

Note：Compared with miR-NC，1）P<0.05.

Cell invasion number（n）140.93±10.76 61.09±5.691）19.678 0.000 Groups miR-431-5p CyclinD1MMP2MMP9OD490 nm miR-NC miR-431-5p t P 1.00±0.11 2.63±0.231）19.180 0.000 0.96±0.09 0.43±0.041）16.144 0.000 0.85±0.08 0.32±0.031）18.610 0.000 0.78±0.07 0.36±0.031）16.545 0.000 1.03±0.09 0.43±0.041）18.033 0.000 Cell migration number（n）182.69±15.06 80.26±7.361）18.332 0.000

图3 Western blot 检测 CyclinD1、MMP2 和 MMP9 蛋白的表达Fig.3 Western blot detects expressions of CyclinD1，MMP2 and MMP9 proteins

2.4 LINC00680 靶 向 miR-431-5p LncBase Pre‐dicted v. 2 网站在线预测结果见图4A，miR-431-5p和LINC00680之间存在部分互补结合位点。双荧光素酶活性检测结果见图4B，与miR-NC 和WTLINC00680 共转染比较，miR-431-5p mimics 和 WTLINC00680共转染后AGS细胞荧光素酶活性显著降低（P<0.05）；与miR-NC和WT-LINC00680共转染比较，miR-431-5p mimics 和 WT-LINC00680 共转染后AGS 细胞荧光素酶活性变化无统计学意义（P>0.05）。 RT-qPCR 检 测 结 果 见 图 4C，pcDNALINC00680 组 AGS 细胞 miR-431-5p 表达量较 pcD‐NA-NC 组显著降低（P<0.05）；si-LINC00680 组AGS细胞miR-431-5p 表达量较si-NC 组显著升高（P<0.05）。

图4 LINC00680靶向miR-431-5pFig.4 LINC00680 targets miR-431-5p

2.5 抑制miR-431-5p 可以逆转抑制LINC00680 对AGS 增殖、迁移和侵袭的影响 结果如图5 和表3所示，与si-LINC00680+anti-miR-NC 组比较，si-LINC00680+anti-miR-431-5p组AGS细胞miR-431-5p表达量显著降低，细胞活力、迁移和侵袭细胞数、CyclinD1、MMP2 和MMP9 蛋白表达量显著升高（P<0.05）。

表3 抑制miR-431-5p表达可以逆转LINC00680低表达对AGS增殖、迁移和侵袭的影响（，n=9）Tab.3 Inhibiting miR-431-5p can reverse effect of LINC00680 inhibition on proliferation，migration and invasion of AGS（，n=9）

表3 抑制miR-431-5p表达可以逆转LINC00680低表达对AGS增殖、迁移和侵袭的影响（，n=9）Tab.3 Inhibiting miR-431-5p can reverse effect of LINC00680 inhibition on proliferation，migration and invasion of AGS（，n=9）

Note：Compared with si-LINC00680+anti-miR-NC，1）P<0.05.

Cell invasion number（n）68.17±5.69 126.05±10.151）14.923 0.000 Groups miR-431-5p CyclinD1MMP2MMP9OD490 nm si-LINC00680+anti-miR-NC si-LINC00680+anti-miR-431-5p t P 1.00±0.11 0.35±0.031）17.103 0.000 0.49±0.05 0.90±0.091）11.947 0.000 0.36±0.03 0.79±0.071）16.939 0.000 0.32±0.03 0.72±0.071）15.757 0.000 0.49±0.04 0.89±0.081）13.483 0.000 Cell migration number（n）90.13±8.52 161.08±13.291）13.483 0.000

图5 Western blot 检测 CyclinD1、MMP2 和 MMP9 蛋白的表达Fig.5 Western blot detects expressions of CyclinD1，MMP2 and MMP9 proteins

2.6 EMT相关蛋白表达变化 结果如图6所示，与si-NC 组比较，si-LINC00680 组 AGS 细胞 E-Cadherin蛋白表达显著升高，N-Cadherin 和Vimentin 蛋白表达显著降低；与si-LINC00680+anti-miR-NC 组比较，si-LINC00680+anti-miR-431-5p 组 AGS 细 胞 E-Cad‐herin 蛋白表达显著降低，N-Cadherin 和 Vimentin 蛋白表达显著升高（P<0.05）。

图6 EMT的相关蛋白的表达变化Fig.6 Expression changes of EMT related proteins

3 讨论

lncRNAs 涉及细胞分化、生长、凋亡、转移等多种生物学过程，其表达改变与肿瘤的发生、转移密切相关。研究显示lncRNA 小核仁RNA 宿主基因1在胃癌组织中表达上调，与临床病理分期、淋巴结转移以及生存时间相关［8］。lncRNA 癌症易感候选基因高表达参与胃癌细胞的体外增殖，迁移和侵袭［9］。lncRNA 肺腺癌转移相关转录本1通过调节血管生成来促进胃癌的致瘤性和转移［10］。这表明ln‐cRNA 在胃癌发生发展中具有重要作用。本研究重点研究LINC00680 在胃癌中的生物学作用，结果显示，胃癌细胞中LINC00680表达水平显著增加，转染si-LINC00680 抑制 LINC00680 表达可降低 AGS 细胞的增殖、迁移和侵袭能力。CyclinD1 通过结合并激活细胞周期蛋白激酶促进细胞周期从G1期进入S期发挥促增殖作用［11］。MMP2 和 MMP9 在肿瘤的转移中发挥主导作用，MMPs 表达增加与胃癌的侵袭转移、淋巴结转移有关，下调MMP2 和MMP9 表达可降低肿瘤细胞的侵袭转移能力［12-13］。抑制LINC00680表达后 AGS 细胞 CyclinD1、MMP2 和 MMP9 蛋白表达均显著降低，与功能分析结果一致。与本研究发现类似，抑制LINC00680 表达还可抑制胶质瘤细胞的增殖、迁移和侵袭，抑制肿瘤生长，并促进细胞凋亡［5］。以上研究表明，LINC00680 在胃癌中具有致癌作用。

在肿瘤进展中，lncRNA-miRNA 相互作用参与其中并发挥关键作用。miR-431-5p 作为一种保守型非编码RNA，已被证实在不同肿瘤中涉及许多生物学功能。研究显示，lncRNA F-box 和富亮氨酸重复蛋白 19 反义 RNA1（FBXL19-AS1）通过靶向 miR-431-5p 参与肺癌细胞的增殖、迁移、侵袭和血管生成［14］。乳头状甲状腺癌组织中miR-431-5p 表达降低，且具有淋巴结转移的患者中miR-431-5p 表达更低［15］。过表达miR-431-5p 可抑制甲状腺癌细胞、肺癌细胞的迁移和侵袭能力［16］。与上述研究类似，胃癌细胞中miR-431-5p 表达显著降低，转染miR-431-5p mimics 过表达 miR-431-5p 可降低 AGS 细胞的增殖、迁移和侵袭能力以及CyclinD1、MMP2 和MMP9蛋白表达水平。进一步分析显示，LINC00680 对miR-431-5p 具有靶向负调控作用。此外，抑制miR-431-5p 表达可逆转抑制 LINC00680 对 AGS 细胞增殖、迁移和侵袭的影响，进而恢复细胞的增殖、迁移和侵袭能力，这进一步说明LINC00680 直接靶向miR-431-5p进而参与胃癌进展。

EMT 是肿瘤细胞获得更高的侵袭和转移能力的关键步骤。在EMT 进程中，上皮细胞丧失其细胞极性、上皮标记物表达经历表型转换获得间质表型，进而降低细胞间黏附力和增加侵袭转移能力［17］。既往研究证实，lncRNA-TUG1 下调 miR-381促进EMT 进而促进胃癌细胞转移［18］。此外，过表达miR-431-5p 显著抑制肝癌和口腔鳞状细胞癌进程［19-20］。本研究中，抑制 LINC00680 表达可降低AGS 细胞中间质标记物N-Cadherin 和Vimentin 表达水平，升高上皮标记物E-Cadherin表达水平，而抑制miR-431-5p 表达可逆转抑制LINC00680 对 E-Cad‐herin、N-Cadherin 和 Vimentin 表达的影响，这表明LINC00680靶向miR-431-5p参与胃癌EMT过程。

综上所述，胃癌中LINC00680 呈高表达。抑制LINC00680 可降低胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力，抑制EMT 进程，其机制与靶向调控miR-431-5p表达有关。因此，LINC00680 有望成为胃癌治疗的有效靶点。