婴幼儿血管瘤的microRNA-circRNA芯片分析①

车霄楠 沙 岩 王 丹 （徐州市儿童医院，徐州医科大学附属儿童医院口腔科，徐州221000）

婴幼儿血管瘤（infantile hemangioma，IH）是新生儿期最常见的良性肿瘤，由毛细血管内皮细胞及其支持组织良性增生所致，患病率占初生婴儿的4%~5%［1-2］。随着患儿生长发育，病变组织可逐渐消褪，亦可随之逐渐发育成熟，内皮细胞逐渐形成血管，即形成由多个发育不完全的扭曲血管构成的肿物。虽然大多数病变可自然消退，但约12%的病例因并发症需要治疗，超过50%的未经治疗的血管瘤可能导致永久的后遗症［3-4］。血管瘤的主要治疗适应症包括危及生命的血管瘤、功能性血管瘤、溃疡和严重的解剖变形［5］。

婴幼儿血管瘤的发病机制尚不明确，目前认为异常的血管瘤细胞通过血管生成促进组织新生血管化［6-8］。microRNAs（miRNAs）已成为血管发育的关键调节因子，在多种疾病过程中调控异常，这些短的、非编码的RNA 分子可抑制基因表达，通过诱导切割或阻断靶mRNA 的翻译［9］。最近一项研究表明，chromosome 19 miRNA 簇（C19MC）在IH 组织和血液样本中均过表达，鉴定C19MC 为IH 的候选生物标志物［10-13］。miR-382 在 IH 中过表达内皮细胞并促进 IH 发展［14］。miR-130a 在 IH 中过表达，可促进血管内皮细胞的增殖、迁移和血管生成[15]。尽管如此，miRNA 在IH 中的作用尚需进一步研究。circ-RNAs 是最近发现的一类参与多种生理过程的ncRNAs，已被证明是调控基因表达的miRNA 海绵［15-16］。一些 circRNAs mRNA 竞争相同的 miRNA结合位点以形成整合的网络后转录调控，即竞争内源性 RNAs（ceRNAs）网络［17-18］。最近，circRNAs 的谱分析已在多种疾病特别是在肿瘤中被鉴定出来，如皮肤鳞状细胞癌、卵巢上皮癌、基底细胞癌［19-21］。然而，关于IH 中circRNA 的研究还很少。因此，本研究主要对IH 细胞中miRNA 及circRNA 的表达及其潜在功能进行研究。

1 材料与方法

1.1 数据来源 本研究使用的miRNA 和circRNA测序数据分别是来自GEO 数据库的GSE69136 和GSE98795 芯片。对于 miRNA，选取 GSE69136 芯片中的16 个样本作为研究对象，其中12 个样本来自患者血管瘤细胞，4 个样本来自患者血管瘤组织临近正常皮肤细胞；对于circRNA，选取GSE98795 芯片中血管瘤组织和临近正常皮肤组织各4个样本进行分析研究。

1.2 miRNA 差异分析 使用GEO2R 工具，对GSE69136 芯片中miRNA 测序数据进行差异表达分析。对分析结果，删除参数残缺的数据项，设置变数倍数和P值进行筛选，得到差异表达的miRNA（DEMis）。

1.3 circRNA 差异分析 使用GEO2R 工具，对GSE98795 芯片中circRNA 测序数据进行差异表达分析。对分析结果，删除参数残缺的数据项，设置变数倍数和P值进行筛选，得到差异表达的circ-RNA（DECis）。

1.4 预测miRNA-circRNA 相互作用关系 RNAhy‐brid 是 Behmsmeier M 等基于 miRNA 和靶基因二聚体二级结构开发的miRNA 靶基因预测工具［22］。本研究从miRBase 获取人类miRNA 序列文件，从circ‐Base 获取 DECis 的序列文件，使用 RNAhybrid 预测工具预测能够与DECis靶向结合的人类miRNA。对预测的结果，保留DEMis 参与的相互作用对，使用Cytoscape软件绘制相互作用网络。

1.5 DEMis 的 KEGG 通路分析 使用David 6.8（http：//david. ncifcrf. gov/tools. jsp）进行差异基因Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）富集分析。以P<0.05 为显著性富集，统计每个Path‐way 中的差异基因数目。通过KEGG 显著性富集分析，确定DEMis参与的主要通路。

2 结果

2.1 miRNA 差异分析 对GEO2R 的分析结果以P<0.05，|log2FC|>1（fold change，FC）为标准筛选差异表达的miRNA，与正常皮肤细胞相比，血管瘤细胞中共得到139个DEMis，其中128个上调miRNAs，11 个下调 miRNAs（图 1）。进一步按照|log2FC|>5 和P<0.05 分别筛选到 55 个上调 miRNAs 和 5 个下调miRNAs。按照差异miRNA倍数排序，表1列举了前10个上调miRNAs和前10个下调miRNAs的信息。

表1 血管瘤细胞中上调/下调差异表达显著的miRNAsTab.1 miRNAs with significantly up-regulated/downregulated expressions in hemangioma cells

图1 血管瘤细胞miRNAs火山图Fig.1 Volcanic plot of miRNAs in hemangioma cells

2.2 circRNA 差异分析 对GEO2R 的分析结果以P<0.05，|log2FC|>1 为标准筛选差异表达的circ-RNA，与正常皮肤细胞相比，血管瘤细胞中共得到1 000 个 DECis，其中 581 个上调 circRNAs，419 个下调circRNAs（图2）。进一步按照|log2FC|>2 和P<0.05 分别筛选到 151 个上调 circRNAs 和 52 个下调circRNAs。按照差异circRNA 倍数排序，表2列举了前 10 个 上 调 circRNAs 和 前 10 个 下 调 circRNAs 的信息。

表2 血管瘤细胞中上调/下调差异表达显著的circRNAsTab.2 circRNAs with significantly up-regulated/downregulated expressions in hemangioma cells

图2 血管瘤细胞circRNAs火山图Fig.2 Volcanic plot of circRNAs in hemangioma cells

2.3 构建miRNA-circRNA 相互作用关系 将DECis 和人类miRNA 的序列文件上传至RNAhybrid工具，设置配对次数为1，能量阈值-30，miRNA 5'端2~7 nt 完全配对，预测得到354 条相互作用关系，共涉及81个DEMis和35个DECis（图3）。

图3 血管瘤细胞中miRNA-circRNA相互作用网络Fig.3 miRNA-circRNA interaction network in hemangioma cells

2.4 DEMis 的KEGG 通路分析 对血管瘤细胞中筛查出来的139 个差异表达的miRNAs 进行KEGG通路分析，以P<0.001 为标准筛查，有10.07%差异表达的miRNAs 富集在癌症发生通路中，分别为miR520A、miR625、miR222、miR200A、miR203A、miR200B、miR200C、miR205、miR143、miR141、miR135B、miR150、miR23C、miR324，KEGG 通路分析显示这些miRNAs 参与了肺癌、食管癌、肝细胞癌、结肠癌、乳腺癌、上皮性卵巢癌、膀胱癌及前列腺癌的信号通路，表明这些差异表达的miRNAs 可能在血管瘤的发生发展中发挥重要作用。

3 讨论

IH 是内皮细胞和周细胞异常增殖引起的婴幼儿最常见的良性血管瘤，具有典型的先快速增殖后缓慢消退的生长特点［2，23］。IH 的发病机制尚不明确，目前认为异常的血管瘤细胞通过血管生成促进组织新生血管化［6-8］。近年来，非编码RNA对肿瘤发生发展作用的机制受到极大关注。miRNA 虽然是非编码RNA，但其转录后基因调控发生在大量的细胞过程中，包括细胞增殖、分化、凋亡和血管生成［24-30］。且miRNA表达模式的改变与许多病理过程甚至一些癌症的发生相关［31-35］。研究发现，miRNAs已成为血管发育的关键调节因子，在多种疾病过程中可抑制基因表达，通过诱导切割或阻断靶mRNA的翻译［9，36］。随着对 miRNA 的深入探索，多种 RNA分子对miRNA 的吸附作用逐渐被发现，这种作用使miRNA 成为复杂调节链中重要的一环，这样有竞争结合miRNA 引发的调节机制被称为ceRNA 机制。其中，circRNA 作为 miRNA 海绵，在 ceRNA 机制中发挥重要作用，miRNA-circRNA 作为肿瘤生物标记物的研究也越来越多。本研究主要通过分析IH 相关的miRNA 及circRNA 的高通量测序芯片，构建miRNA-circRNA 相互作用关系，探索血管瘤潜在的生物标记物。通过GSE69136数据分析miRNA 差异表达，最终得到139 个DEMis，其中大部分DEMis 为表达上调miRNAs。进一步的KEGG富集分析发现，这些DEMis 中有14 个miRNAs 富集在癌症发生通路。通过GSE98795数据分析circRNA 差异表达，在血管瘤细胞中共得到1 000 个DECis，其中581 个上调 circRNAs，419 个下调 circRNAs。进一步根据|log2FC|>2 和P<0.05，分别筛选到 151 个上调 circ-RNAs 和 52 个下调 circRNAs。将 DECis 和人类 mi-RNA 的序列文件上传至RNAhybrid 工具，预测得到354 条相互作用关系，共涉及 81 个 DEMis 和 35 个DECis。对 DEMis 的 KEGG 通路分析发现，有 14 个差异miRNA 富集在癌症发生通路中。通路分析显示这些miRNAs 参与了肺癌、食管癌、肝细胞癌、结肠癌、乳腺癌、上皮性卵巢癌、膀胱癌及前列腺癌的信号通路，表明这些miRNAs 可能在血管瘤的发生发展中发挥重要作用。

综上所述，通过对GEO 数据库中的IH 芯片数据进行分析，本研究获取了IH 中差异表达的mi-RNAs 和circRNAs。通过信号通路富集分析发现，在IH 发生发展过程中起重要作用的信号通路为癌症发生信号通路，关键miRNAs 可能为miR520A、miR625、miR222、miR200A、miR203A、miR200B、miR200C、 miR205、miR143、miR141、miR135B、miR150、miR23C、miR324，这为探索 IH 的发生机制提供重要依据。